GDNF基因修飾的NSCs聯合EPO通過Nrf2-COX2/iNOS保護帕金森小鼠神經功能

王淑華，周正麗，湯華軍，王 云，李開榮，孫國剛，胡光強，陳 波

西南醫科大學：1.口腔醫學專業；2.基礎醫學院人體解剖學教研室（瀘州 646000）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者一個主要特征是中腦的黑質內大量多巴胺能神經元的缺失和紋狀體多巴胺的缺失。目前認為多巴胺與神經元的退化變性與氧化應激、神經炎癥、凋亡及衰老等因素有關[1-3]。多巴胺受體激動劑或外源性補充多巴胺目前仍是主要治療手段，但帕金森病屬于一種進展性疾病，藥物治療也只是控制癥狀，而不能阻止疾病的發展。近年來神經干細胞、誘導多能干細胞、間充質干細胞、胚胎干細胞等干細胞替代治療在PD治療中顯示出巨大的潛力，可在不同程度上改善PD，但仍存在一些問題，比如遺傳和表觀遺傳異常、多巴胺能神經元的低產量以及細胞治療的安全性等[4]。

神經膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）主要是多巴胺能神經營養因子，而GDNF 是維持神經元形態和神經化學表型，保護多巴胺（dopamine，DA）神經元免受毒性損傷所必需的生物因子[5]。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）在神經退行性疾病動物模型中已被證明具有抗氧化、抗炎和神經保護作用，也可以促進血管生成[6]。GDNF 和EPO 聯合應用可提高移植物療效，加速功能恢復。目前檢索文獻未見GDNF基因修飾的NSCs與EPO 聯合治療PD 的報道。在本研究中，我們推測GDNF基因修飾的NSCs 與EPO 的聯合將具有協同作用，增強其對PD模型小鼠的神經保護作用。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

C57BL/6 小鼠神經干細胞（MUBNF-01001）及其完全培養基（MUBNF-90011）均購自Cyagen Biosciences 公司；重組腺病毒pAdTrack CMV-GDNF plasmid 來自西南醫科大學基礎醫學研究中心神經生物研究室；MPTP（M0896，Sigma）；EPO（CYT-201，Propsec）；組織線粒體分離試劑盒（C3606，Beyotime）；線粒體膜電位分析試劑盒JC-1（C2006，Beyotime）；Transcriptor First strand cDNA synthesis kit（04896866001，Roche）；qPCR SYBR Green Master Mix（Q111-03，Vazyme）。

1.2 實驗動物

健康雄性C57BL/6 小鼠120 只，體重22～25 g，購自西南醫科大學實驗動物中心。飼養房溫度24 ℃，自由飲食水。實驗動物操作和處理符合西南醫科大學實驗動物倫理委員會對動物實驗的倫理要求（動物實驗倫理批準號：SWMU201803147）。

2 實驗方法

2.1 重組腺病毒pAdTrack CMV-GDNF轉染NSCs

將NSCs接種至6 cm培養皿中，待細胞生長至融合度為90%時，用0.25%胰酶消化收獲細胞吹打成單細胞懸液，調整細胞密度1×105/mL，接種于24孔板，每孔接種250 μL。次日每孔加入5 μL pAdTrack CMV-GDNF重組腺病毒質粒（1.2×108TU/mL），混勻后置孵箱，培養4 h 后，各孔再添加250 μL 完全培養基，培養24 h后，撤病毒液更換正常培養基并用嘌呤霉素篩選后擴增備用。

2.2 MPTP誘導PD模型、分組及各組處理

成年C57BL/6 雄性小鼠120只隨機分為8組，正常組（Normal）、假手術組（Sham）、模型組（MPTP）、Sham+EPO 組、Sham+GDNF-NSCs 組、MPTP+EPO 組、MPTP+GDNF-NSCs 組和MPTP+GDNF-NSCs+EPO組，每組15 只。MPTP 無菌生理鹽水稀釋后按照35 mg/kg 腹腔注射，1 次/d，連續7d；動物出現暫時性軀干震顫、豎毛、尾巴過伸等癥狀，按照震顫麻痹評分表（表1）評估建模是否成功，評分不低于2分者納入后續實驗。MPTP 建模結束后，小鼠麻醉后置于小鼠腦定位儀（51730U，Stoelting 公司）上。參考《小鼠腦立體定向圖譜》第二版（澳大利亞George Paxinos 教授和加拿大Keith B.J.Franklin教授合編）確定紋狀體移植坐標（前囟后1.0 mm，中線旁開2.0 mm，深度2.5 mm）。用5 μL微量注射器，每只小鼠接受3 μL細胞懸液（2×105），左、右側紋狀體各注射1.5 μL 細胞懸液。注射速度約0.5 μL/min，停針10 min 后緩慢退針，針孔用無菌骨蠟封口。Sham組紋狀體注射等體積生理鹽水。

表1 震顫麻痹評分Table 1 Paralysis tremor scores

2.3 小鼠行為學評估旋轉實驗和爬桿實驗

建模前及建模后第7、14、28和42 d對各鼠進行行為學檢測，旋轉實驗時所有小鼠在一根直徑約3 cm的旋轉桿上訓練獲得統一基線水平后才開始MPTP 注射。旋轉桿轉速每分鐘25 圈，每次桿上維持不超過5 min，間隔5 min，連續3次。正式實驗時記錄大鼠在180 s內桿上持續時間，間隔5 min旋轉3次取平均值。爬桿實驗正式實驗前也訓練至統一基線水平，所有小鼠在一根長30 cm，寬8 mm的豎立的桿上訓練。頭放置于桿頂部，記錄小鼠爬到桿底部的時間。正式實驗時，小鼠每次爬桿3次，記錄時間取平均值。

2.4 紋狀體多巴胺含量測定

行為學評分結束后，迅速斷頭后取腦，冰上分離紋狀體，稱重后將紋狀體放入1 mL冰冷溶液（含0.1 mol/L高氯酸和0.4 mol/L亞硫酸鈉）中，用玻璃勻漿器手動勻漿。離心后取少量勻漿液用BCA 蛋白定量試劑盒測總蛋白。余下組織勻漿液在4 ℃，10 000 r/min離心15 min后取上清液，再用0.45 μm 孔徑一次性濾過器過濾，濾液進行高效液相-電化學法測DA 含量。電化學檢測器（UltiMate?3000 ECD-3000RS，美國）電壓0.7 V，進樣量20 μL，流速0.6 mL/min。最后計算紋狀體內總DA含量，結果用μg/g 組織總蛋白表示。

2.5 紋狀體線粒體提取及膜電位檢測

根據組織線粒體分離試劑盒說明分離收集紋狀體線粒體沉淀，線粒體膜電位檢測參照JC-1試劑盒說明步驟進行。JC-1單體和聚合物激發后分別發綠色和紅色熒光，以紅、綠熒光的比值代表線粒體的膜電位高低。比值越高，說明線粒體的膜電位越高。

2.6 紋狀體組織Nrf2、COX2和iNOS基因檢測

紋狀體取出后，采用常規Trizol 法提取組織總RNA。使用cDNA 逆轉錄試劑盒和SYBR Green Master Mix分別進行逆轉錄和熒光定量PCR。各基因引物合成來自上海生工生物工程股份有限公司（表2）。熒光定量PCR 儀（Bio-Rad CRX96TM，美國）反應條件：預變性95 ℃，5 min；循環反應95 ℃，10 sec、60 ℃，30 sec，39個循環；融解曲線95 ℃，15 sec、60 ℃，60 sec、95 ℃，15 sec。

表2 Nrf、COX2和iNOS基因引物Table 2 Primers of Nrf,COX2 and iNOS

2.7 統計學分析

用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料均用均數±標準差（）表示。以測定時間點為重復測量因素和組內因素，處理方式為組間因素，采用重復測量方差分析時間和組別交互作用是否對測量因素有顯著影響，Tukey事后檢驗分析組間差異，P ＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 行為學

旋轉實驗分析結果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=7.924，P ＜0.001），不同時間點對桿上持續時間有顯著影響（F=2 448.312，P ＜0.001）。在MPTP 注射后第7 d，模型鼠在180 s 內桿上持續時間較正常組、Sham組、Sham+EPO組和Sham+GDNF-NSCs組明顯下降。EPO、GDNF-NSCs 和GDNF-NSCs+EPO 干預后在第14、28 和42 d 桿上持續時間均較第7 d 顯著增加（P ＜0.001）。第28 d 時，MPTP+GDNF-NSCs+EPO 組增加較MPTP+GDNF-NSCs 組（P ＜0.001）和MPTP +EPO 組（P ＜0.001）更明顯。第48 d，MPTP+EPO 組和MPTP+GDNF-NSCs 組大鼠桿上持續時間下降，但MPTP+GDNF-NSCs+EPO 組大鼠桿上持續時間仍呈上升趨勢，且這種上升趨勢較單獨干預的MPTP+EPO組（P ＜0.001）和MPTP+GDNF-NSCs 組（P ＜0.001），差異具有統計學意義（表3）。

表3 MPTP誘導建立小鼠帕金森模型，經EPO、GDNF-NSCs和兩者聯用干預后評估各組不同時間旋轉行為學時間變化（s）Table 3 MPTP-induced Parkinson's mouse model,and the time changes of rotation behavior in each group at different time points were evaluated after EPO,GDNF-NSCs and their combined intervention(s)

爬桿實驗分析結果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=3.694，P ＜0.001），對桿上下來時間影響顯著，不同時間點之間也存在顯著差異（F=232.023，P ＜0.001）。在MPTP 注射后第7 d，模型鼠從桿上下來時間較正常組和Sham 組明顯增加（P ＜0.001）。EPO、GDNF-NSCs 和GDNF-NSCs+EPO 干預后在第14、28和42 d 從桿上下來時間均較第7 d 顯著降低（P ＜0.001）。第14、28 和42 d 時MPTP+GDNF-NSCs+EPO組（P ＜0.001）和MPTP+GDNF-NSCs 組（P=0.015）下桿時間均較MPTP+EPO 組下降更顯著，但MPTP +EPO 組爬桿時間沒有明顯變化，聯合干預組爬桿時間進一步下降接近正常組（表4）。

表4 MPTP誘導建立小鼠帕金森模型，經EPO、GDNF-NSCs和兩者聯用干預后評估各組不同時間爬桿行為學時間變化（s）Table 4 MPTP-induced Parkinson's mouse model,and the time changes of pole climbing behavior in each group at different time points were evaluated after EPO,GDNF-NSCs and their combined intervention(s)

3.2 紋狀體多巴胺含量

紋狀體多巴胺含量分析結果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=6.559，P ＜0.001），對紋狀體多巴胺含量影響顯著。不同時間點之間也存在顯著差異（F=1 159.502，P ＜0.001）。MPTP注射第7 d，小鼠紋狀體多巴胺含量較正常組明顯下降（P ＜0.001）。GDNF-NSCs、EPO 和聯用治療后，在第14、28 和42 d 紋狀體多巴胺含量均較第7 d 顯著增加（P ＜0.001），也均較MPTP 模型組明顯增加（P ＜0.001）。單純EPO 治療組隨時間延長呈下降趨勢，而聯用治療組隨時間延長較MPTP+GDNF-NSCs組（P ＜0.001）和MPTP+EPO組（P ＜0.001）增加更明顯（表5）。

表5 小鼠紋狀體多巴胺含量變化（ng/g）Table 5 Changes of dopamine content in striatum of mice(ng/g)

3.3 紋狀體線粒體膜電位

紋狀體線粒體膜電位分析結果顯示組別與時間之間有交互作用（F交互=4.187，P ＜0.001），對紋狀體線粒體膜電位影響顯著。不同時間點之間也存在顯著差異（F=501.359，P ＜0.001）。MPTP 注射后第7 d，小鼠紋狀體線粒體膜電位較正常組和Sham 組明顯下降。GDNF-NSCs、EPO 和聯合干預后，在第14、28 和42 d時，三組線粒體膜電位均較第7 d時顯著增加。在第14、28 和42 d，GDNF-NSCs 和聯合干預組也較MPTP 組線粒體膜電位顯著增加。EPO 治療在第14、28 和42 d 時沒有顯著差異。聯合治療組在第14、28和42 d時線粒體膜電位也較單純GDNF-NSCs治療組顯著增加（表6）。

表6 小鼠紋狀體線粒體膜電位（紅/綠，%）變化Table 6 Changes of mitochondrial membrane potential(red/green,%)in striatum of mice

3.4 紋狀體組織抗氧化相關基因表達

熒光定量PCR 檢測抗氧化基因Nrf2、COX2和iNOS表達結果分析顯示：組別與時間之間有交互作用（Fnrf2交互=2.256，P=0.004；Fcox2交互=4.329，P ＜0.001；Fi-NOS交互=7.905，P ＜0.001），均對紋狀體抗氧化相關基因影響顯著。在不同時間點檢測也存在顯著差異（Fnrf2=46.569，P ＜0.001；Fcox2=1 544.488，P ＜0.001；FiNOS=3 232.150，P ＜0.001）。MPTP 腹腔連續注射7 d 時MPTP組、MPTP+EPO 組、MPTP+GDNF-NSCs 組和MPTP+GDNF-NSCs+EPO 組 紋 狀 體Nrf2、COX2和iNOS的mRNA 水平均較Normal 組和Sham 組顯著增加（P ＜0.001）。在第14、28和42 d 時，GDNF-NSCs 及聯合干預后，Nrf2、COX2和iNOS的mRNA水平均較第7 d時顯著降低；在第28、42 d 時，EPO 干預組Nrf2、COX2和iNOS的mRNA 水平均較第7、14 d 時顯著降低（P ＜0.001）；聯合干預組COX2和iNOS的mRNA 水平在第14、28 和42 d 時也較GDNF-NSCs 干預組顯著降低（P ＜0.001）（表7，8，9）。

表7 各組不同時間點小鼠紋狀體Nrf2基因表達變化Table 7 Changes of Nrf2 gene expression in striatum of mice at different time points in each group

4 討論

帕金森病已經成為社會人群中主要的中樞神經退行性疾病之一，研究資料提示，遺傳因素為PD 的主要根源，環境因素是誘導因素，氧化應激、免疫異常等是發病表現。目前左旋多巴仍為治療PD 的一線臨床藥物，是PD 患者因多巴胺分泌不足采用的替代療法，治標不治本。因此，需要尋找新的治療方法，本文利用GDNF基因修飾的NSCs 聯合EPO 治療帕金森小鼠，顯示兩者聯用在針對多巴胺含量、線粒體膜電位、抗氧化相關基因的表達方面，較單一治療有明顯優勢，且兩者聯用治療效果能持續到建模后42 d；聯用組行為學檢測旋轉實驗和爬桿實驗也顯示相似的趨勢，提示兩者聯用使帕金森小鼠的神經功能得到明顯改善。PD最主要病理改變是中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡而引起紋狀體DA 含量的顯著性減少。有文獻報道在MPTP 誘導的大鼠[7]和非人靈長類動物[8]帕金森疾病模型中，GDNF均顯示對黑質紋狀體神經元的保護作用。由于GDNF 不能透過血腦屏障，并且腦室內給藥有強烈的副作用[9]，因此目前主要通過構建過表達GDNF基因的各類病毒載體，如腺病毒[10]、腺相關病毒[11]等病毒載體或者構建過表達GDNF基因干細胞，如間充質干細胞[12]、神經干細胞[13]等干細胞，經靜脈或腦內定向注射給藥。本文用GDNF基因修飾的神經干細胞治療帕金森小鼠也顯示出治療有效性，和文獻報道是一致的。

表8 各組不同時間點小鼠紋狀體COX2基因表達變化Table 8 Changes of COX2 gene expression in striatum of mice at different time points in each group

表9 各組不同時間點小鼠紋狀體iNOS基因表達變化Table 9 Changes of iNOS gene expression in striatum of mice at different time points in each group

氧化應激和神經炎性是帕金森疾病多巴胺能神經退變的早期事件，也是帕金森疾病的成因之一。腦富含線粒體，而線粒體是細胞內活性氧的主要來源，其膜電位的下降是細胞早期凋亡的一個標志性事件。研究結果顯示GDNF-NSCs 能在較長時間內持續增加線粒體膜電位，在聯用EPO 后，這種改變更顯著。EPO 是由腎小管周圍間質細胞和肝臟分泌的一種激素樣物質，能夠增強機體對氧的結合、運輸和供應能力，一方面有利于紋狀體內移植的神經干細胞存活，另一方面，可緩解腦內多巴胺能神經元凋亡[14]。已有文獻報道，在帕金森疾病模型中，EPO 發揮神經保護作用依賴于PI3K/Akt/FoxO3a 信號通路的激活，減少紋狀體神經元凋亡，顯著改善帕金森疾病模型的功能評分[15]。本文利用GDNF-NSCs 和EPO 聯用顯示出治療帕金森疾病的協同效應，提示治療帕金森疾病多巴胺能神經元早期凋亡程度有所減輕。

Nrf2是目前已知的內源性抗氧化應激關鍵蛋白之一，對外源性氧化刺激敏感，激活后從細胞骨架解離進入核內，和抗氧化反應元件結合，啟動下游數百種抗氧化、抗炎及抗凋亡相關基因的表達[16]。已有文獻報道Nrf2/ARE信號在電針治療帕金森疾病中發揮抗氧化作用[17]。在帕金森疾病模型中紋狀體COX2基因表達增加使運動功能障礙更甚[18]。iNOS可存在于內皮細胞、巨噬細胞、神經吞噬細胞及神經細胞中，在不同腦區呈選擇性分布，在帕金森患者腦內，iNOS 表達增加[18]。在嚙齒類動物研究中也顯示iNOS 表達增加在慢性炎癥過程及其他一些疾病中可能起有害作用，抑制iNOS表達能減輕帕金森疾病運動功能障礙并阻止COX2表達增加[19]。所以，抗炎和抗氧化應激在帕金森疾病治療中有重要價值。研究結果顯示，治療組紋狀體Nrf2基因表達均較帕金森模型組增加，且GDNF-NSCs組顯著增加；COX2基因和iNOS基因表達均較模型組減少，且GDNF-NSCs 組下降更顯著，提示GDNF-NSCs 治療帕金森疾病的可能機制是通過增加Nrf2基因表達、下調iNOS和COX2 基因表達達到抗氧化應激和抗炎等作用。但同時也發現，即使使用GDNF-NSCs 和EPO 聯合治療帕金森模型小鼠，小鼠的行為學功能也不能恢復到正常水平，由于帕金森疾病病因仍不清楚，該治療方法仍有局限性，有待進一步深入研究，尋找更好的治療方法。

5 結論

GDNF基因修飾的NSCs聯合EPO可能通過增加氧化應激抵抗發揮帕金森小鼠神經保護作用。基于GDNF基因修飾的神經干細胞聯合EPO治療帕金森病有一定的應用價值。

（利益沖突：無）