鹿角可再生動物模型建立與即刻加載對種植體及其周圍骨改建的作用

沈 潔，陳俊良，趙田琦，謝冰清，呂冬梅，何 蕓

1.西南醫科大學口頜面修復重建和再生實驗室（瀘州 646000）；2.西南醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科（瀘州 646000）

種植修復是目前被廣泛認可和最為流行的口腔修復體之一。即刻加載種植是指種植體植入后，一周內即行上部修復并加載行使功能。與傳統延遲加載種植（需等待3～6個月的骨整合完成后才能加載）相比，即刻加載種植大大縮短了療程，減少了就診次數，即時解決了患者的美觀、咀嚼和語音等問題[1-3]。臨床和動物研究表明：即刻加載種植與傳統延遲加載種植具有相似的種植體穩定性和成功率，其種植體邊緣骨組織和軟組織變化水平無統計學差異[4-6]。但是，即刻加載作用下的骨改建對骨整合是促進還是妨礙卻存在爭議，其中重要的原因可能是，現有的人群/動物研究模型干擾因素多，載荷不可控。

動物模型操作性和可控性強，被廣泛應用于醫學研究，代替人體模型探討人類疾病的發病和防治。就口腔種植而言，國內外大量學者，以狗、兔、老鼠等動物為模型進行相關研究，將種植體植入其頜骨或其他長骨[7-9]。但是，這些動物模型結果不一，問題較多：①種植體植入、取出和加力等，持續給動物帶來傷害，還會產生額外的應力，影響實驗結果；②這些研究往往在動物的頜骨或長骨等部位植入種植體，采用的加力方式難以準確控制，且動物的進食和日常生活可能影響加力；③實驗完成后，動物往往需要處死。

鹿角是哺乳動物中唯一可完全再生的器官，研究表明在快速生長期其組織結構、化學組成成分和物理特性與骨組織相同[10-12]。這提示，鹿角可以作為植入床用于種植體相關研究。本研究擬利用專用可控加載設備對植入鹿角的種植體進行即刻加載，建立新型即刻加載種植研究動物模型，對比分析即刻加載和不加載對種植體及其周圍骨組織改建的作用，旨在探索新型的、可再生的、可控的、易操作的動物模型用于即刻加載種植體及其周圍骨改建研究，為進一步揭示即刻加載種植體周圍骨改建的動態過程及其機制和指導臨床種植修復體加載策略奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

在夏季鹿角處于快速生長期時，選取四川省宜賓市欣榮梅花鹿養殖場的健康成年雄性梅花鹿6 只，體重：100～130 kg；年齡：約4歲。動物實驗程序按照赫爾辛基倫理標準執行，并獲得西南醫科大學倫理委員會批準（審批號：2019002）。

1.2 儀器設備

正置相差顯微鏡BX43 和SZX7（Olympus，日本）；Micro-CT（平生醫療Venus，中國）。

1.3 實驗方法

所有動物按照標準程序采用二氧化碳式氣槍近距離發射含1.2～1.5 mL Hellabrunn’s 混合麻醉劑（每毫升包含100 mg氯胺酮和125 mg甲苯噻嗪）的飛鏢對動物進行麻醉[13]。麻醉顯效后，將動物搬運到手術室置于手術臺上，手術區域（左側鹿角）使用75%酒精和1%碘酊消毒后，2%利多卡因3.0～5.0 mL 行局部浸潤麻醉。在鹿角鄰近根部約5.0 cm的位置做切口，切開鹿茸并翻瓣，按照種植體備洞要求逐級備洞，隨后植入3.5×10.0 mm 的種植體（Dentium Co.Ltd.，Seoul，Korea）。每只梅花鹿均僅在其左側的鹿角植入2枚種植體，2枚種植體相距3.0 cm 左右，其中一枚種植體用專用的加載設備進行即刻加載[14]，該加力設備通過三枚距離為120°的螺釘穩定地固定于鹿角上，通過配置一個12 V的鋰電源，其工作頭可以對種植體基樁進行加載。本研究中調整其加載方向為垂直于種植體長軸，力值大小為10 N；而另一枚種植體不加載作為對照，見圖1。然后用可吸收線縫合鹿茸。術后4周、8周，分別按照隨機數字表選取3只動物，用環鉆取標本，每只動物取種植體及其周圍鹿角組織的標本2個。將標本置于4%福爾馬林中固定。鹿角的創口，用骨蠟封閉。

圖1 種植體植入鹿角和即刻加載Figure 1 Implants were inserted into the antlers and immediate loading

術后每天觀察動物傷口及其活動情況，如傷口有無感染等并發癥、動物全身身體情況、有無異常行為、進食情況、鹿角生長情況以及種植體有無松動脫落等。

1.4 影像學檢查

Micro-CT（Venus VNC-102，蘇州平生醫療，中國）掃描標本，掃描參數為電壓90 KVp，電流0.06 mA，分辨率20.0 μm，保持種植體與掃描平面垂直，掃描完成后行三維重建。

選取各時間點各組種植體周圍1.0 mm 鹿角組織，進行骨計量學分析，見圖2。主要分析指標：種植體-骨結合率（bone-implant contact，BIC）、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等。

圖2 Micro-CT選取種植體周圍1.0 mm的鹿角組織行骨計量學分析Figure 2 Micro-CT was used to select 1.0 mm antler tissue around the implant for bone metrology analysis

1.5 統計學方法

所有數據均采用SPSS 22.0 進行分析，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 以（x±s）表示。獨立樣本t檢驗比較同時間點加載和未加載組上述參數的差異，并比較兩組組內不同時間點上述參數的差異。P ＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

術后傷口無感染、腫脹等并發癥，動物進食正常，全身身體情況和活動無異常，植入種植體體側鹿角的生長與對側無變化，鹿角可以在冬天自行脫落，在第二年的春天又開始生長。整個觀察過程中，種植體和加載設備無松動脫落等。

2.1 影像學觀察結果

種植體周圍鹿角組織的影像學觀察，見圖3。隨著術后時間的延長，種植體周圍的鹿角組織逐漸長入種植體螺紋，種植體周圍鹿角組織的新生骨數量逐漸增加，加載組種植體周圍鹿角組織較未加載組致密，特別是8周加載組可見種植頸部大量高密度的鹿角組織

圖3 種植體周圍1.0 mm鹿角組織的Micro-CT分析結果Figure 3 Micro-CTanalysisresultsof1.0mmantlertissuearoundimplant

2.1.1 BV/TV 值結果 隨著術后時間的延長，未加載和加載組的BV/TV 值均逐漸增加，其差異具有統計學意義（P ＜0.05）。同一時間點，加載組的BV/TV 值均大于未加載組，但是其差異沒有統計學意義（P ＞0.05），見表1。

表1 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織的BV/TV（%）值Table 1 BV/TV(%)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

表1 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織的BV/TV（%）值Table 1 BV/TV(%)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

2.1.2 Tb.Th值結果 隨著術后時間的延長，未加載和加載組的Tb.Th值均逐漸增加，其差異具有統計學意義（P ＜0.05）。同一時間點，加載組的BV/TV 值均大于未加載組，其差異具有統計學意義（P ＜0.05），見表2。

表2 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織的Tb.Th（mm）值Table 2 TB.Th(mm)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

表2 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織的Tb.Th（mm）值Table 2 TB.Th(mm)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

2.1.3 Tb.Sp 值結果 隨著術后時間的延長，未加載和加載組的Tb.Sp值均逐漸減小，其差異具有統計學意義（P ＜0.05）。同一時間點，加載組的Tb.Sp值均小于未加載組，其中4周時未加載和加載組的Tb.Sp值差異具有統計學意義（P ＜0.05），見表3。

表3 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織Tb.Sp（mm）值Table 3 TB.Sp(mm)values of antler tissue around implant at different time points in each group（，n=3）

表3 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織Tb.Sp（mm）值Table 3 TB.Sp(mm)values of antler tissue around implant at different time points in each group（，n=3）

2.1.4 Tb.N值結果 隨著術后時間的延長，未加載和加載組的Tb.N 值均逐漸增加，其中未加載組4 周和8周的Tb.N值差異具有統計學意義（P ＜0.05）。同一時間點，加載組的Tb.N值均大于未加載組，其中4周時加載組和未加載組的Tb.N 值差異具有統計學意義（P ＜0.05），見表4。

表4 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織的Tb.N（mm-1）值Table 4 Tb.N(mm-1)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

表4 各組不同時間點種植體周圍鹿角組織的Tb.N（mm-1）值Table 4 Tb.N(mm-1)values of antler tissues around implants at different time points in each group（，n=3）

3 討論

鹿角是顱骨的突起，其再生周期為一年，周期通常開始于春季，在夏季迎來快速增長期和側枝形成期，并在夏末秋初的時候從鹿角根部逐漸向尖端開始鈣化；鈣化完成后，隨著血供和神經組織的丟失，鹿茸逐漸萎縮、脫落。最后，失去了鹿茸覆蓋的鹿角在春季脫落，又開始下一個周期[15]。鹿角的快速生長期為3～4個月[16]，這一時期與種植體的骨整合時間較為吻合，因此可用于觀察種植體周圍動態骨改建。鹿角在快速生長期其長度逐漸變長，適合種植體植入和觀察的時間大約為2～3 個月。前期實驗發現，鹿角的骨改建比人類牙槽骨改建活躍，即刻加載種植體植入6 周后可形成骨整合[17]，因此本文選取了4周、8周作為觀察時間點。本研究以鹿角為植入床，探討即刻加載對種植體周圍骨改建的作用，成功的建立了這一新型可再生動物模型，研究表明該動物模型具有以下優點：①整個實驗不涉及對動物的處死，鹿角可以再生以供循環使用，這對動物的傷害可以降到最低；②鹿性格溫和，飼養容易，鹿角在快速生長期其血運循環豐富，鹿角的尺寸允許植入臨床常用的牙種植體；③鹿角暴露在外，行種植體植入術以及取材等都比其他部位，如頜骨、顱骨、脛骨等，更加簡單方便；④鹿角沒有肌肉的附著，對種植體即刻加載時可以排除肌肉等其他力學因素的影響。

Micro-CT 技術是非破壞性的微米級顯微3D 成像技術，目前已廣泛應用于骨微觀結構的基礎和臨床研究相關研究[18-19]。相對于傳統的組織形態學測量方法，Micro-CT 技術具有無破壞性、成像迅速、高精度的特點，獲取的數據進行3D 重建和分析時，可以根據需要選定合適的目標區域，并根據灰度閾值對不同密度的結構進行精確地分析和計算，還可以用于后期的數字化模擬研究，這可以更為全面立體觀察組織結構的三維形態學特征和變化，為相關實驗提供可靠的理論參考[20-22]。本研究采用Micro-CT 觀察比較植入鹿角的即刻加載和未加載種植體周圍鹿角組織的微觀結構變化，以揭示即刻加載對種植體周圍骨改建的作用。研究表明：種植體周圍1.0 mm左右的組織的骨改建是種植體成敗的關鍵，種植體的骨結合失敗和種植體松動脫落常與該部位的骨改建密切相關[23]。因此，本研究選取種植體周圍1.0 mm的鹿角組織進行骨計量學分析。研究結果表明：隨著術后時間的延長，種植體周圍的鹿角組織逐漸長入種植體螺紋，種植體周圍鹿角組織的BV/TV，Tb.Th 和Tb.N 值均逐漸增加，而Tb.Sp 值則不斷減小。這說明隨著愈合時間的增加種植體周圍的鹿角組織的骨形成逐漸活躍。加載組和未加載組比較結果可見，同一時間點，加載組種植體周圍1.0 mm 的鹿角組織的BV/TV，Tb.Th和Tb.N值均大于未加載組，其中二組的Tb.Th值以及4周的Tb.N值差異具有統計學意義（P ＜0.05）；而加載組Tb.Sp 值則小于未加載組，其中4 周時未加載和加載組的Tb.Sp 值差異具有統計學意義（P ＜0.05）。這說明，種植體植入后即刻可控的小力值加載有利于種植體周圍的骨改建和骨形成，可能可以在早期加速種植體與周圍骨組織的骨整合形成。本研究結果BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和Tb.N的范圍值與其他動物模型的研究結果具有相似之處。HUANG等[24]運用Micro-CT 以比格犬下頜骨為植入床比較富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）和貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）對種植體周圍骨改建的作用，結果表明術后各組BV/TV 值范圍為（41.0 ± 10.7）%～（72.9 ± 5.5）%；Tb.Th 值范圍為（0.18 ± 0.01）mm～（0.24 ± 0.03）mm；Tb.Sp 值范圍為（0.22 ± 0.04）mm～（0.51±0.11）mm。TAN 等[25]以兔的脛骨為植入床探討辛伐他丁對種植體周圍骨改建的作用，結果表明術后1周各實驗組BV/TV 值范圍為（37.23±2.48）%～（58.77± 4.20）%；Tb.Th 值范圍為（0.14 ± 0.01）mm～（0.16 ±0.01）mm；Tb.N 值范圍為（2.66 ± 0.44）mm-1～（5.64 ±0.26）mm-1；Tb.Sp 值范圍為（0.26 ± 0.01）mm～（0.41 ±0.02）mm。

本研究也有其局限性，首先作為一個探索性研究，其樣本量不多。其次鹿角的獲取和飼養相對于鼠、兔、狗等其他動物而言，需要專門的場所，且梅花鹿多為野外放養。后期的研究我們將加大樣本量，并增加組織學、分子生物學等研究手段。

4 結論

本研究成功建立了鹿角這一新型的、可再生的、可控的和易操作的動物模型，并進一步用于即刻加載種植體及其周圍骨改建研究，為相關實驗動物模型的建立提供了新思路。同時，研究進一步證實了可控的適當的即刻加載可以促進種植體周圍的骨改建和骨結合，這為指導臨床種植修復體加載策略奠定了基礎。

（利益沖突：無）