珍稀食用菌紫陀螺菌三峽區域資源調查與化學成分分析*

譚愛華，李方橋**，鄧夢勻，胡飛飛

（1.湖北三峽職業技術學院，湖北 宜昌 443000；2.三峽大學生物與制藥學院天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

紫陀螺菌 [Gomphus purpuraceu(Iwade)Yokoyamas]隸屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina） 非褶菌目（Aphyllophorales） 陀螺菌科（Gomphaceae） 陀螺菌屬（Gomphus）[1]。作為一種珍稀食用菌，紫陀螺菌味道鮮美、營養豐富，且含有蛋白質、維生素、糖類以及微量元素等多種營養成分，同時具有易保鮮、易加工等特點，在食品和藥品領域具有很大的開發價值[2]。但是目前國內對紫陀螺菌的研究報道甚少，據現有對紫陀螺菌子實體化學成分的研究報道[3]，已從紫陀螺菌子實體中分離得到6種化合物，分別為 ergosta-4，6，8 （14），22-tetraen-3-one、4-hydroxy-4-methylpentan-2-one、5，8-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol、methyl 1H-indole-3-carboxylate、3β，5α，9α-trihydroxyergosta-7，22-diene-6-one、purpuracolide。基于上述背景，對紫陀螺菌的形態特征、生長環境及分布進行了初步調查。現將紫陀螺菌三峽區域的資源調查及其化學成分的提取、分離與鑒定情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紫陀螺菌子實體來源于中國三峽地區西陵峽河谷區，由珍稀食用菌紫陀螺菌菌種繁育技術研究課題組保存。

1.2 試驗儀器

FA2204B（0.1 mg）電子分析天平，上海越平科學儀器有限公司；N-1100旋轉蒸發儀，日本EYELA儀器公司；Bruker-ARX-400核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司；Waters高效液相色譜儀1525EF，美國WATERS；Dionex高效液相色譜儀Ultimate 3000，美國Dionex；制備型色譜柱： YMC-Pack ODS-A C18，5 Y，100?，100?C-Pa；薄層層析用硅膠GF254：200目～300目柱層層析硅膠，青島海洋化工廠生產；Sephadex LH 20葡聚糖凝膠，Merk公司產品；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫陀螺菌三峽區域的資源調查

對西陵峽河谷區紫陀螺菌資源現狀進行了走訪和實地調查，觀察并記錄紫陀螺菌的地理分布、生長環境及主要形態特征。此外，在紫陀螺菌生長地宜昌市兆吉坪村八組林地進行定點觀測，選擇了3個樣地，觀測其地形、海拔、植被、氣候、土壤等環境因子與紫陀螺菌生長發育的關系。

1.3.2 化學成分的提取與分離

取干燥的紫陀螺菌子實體粉末160 g，用3倍體積甲醇浸提，共3次，每次12 h。提取液合并后減壓濃縮得到總浸膏10 g，將浸膏在水中充分混懸后，分別用石油醚（料液比1∶2）、二氯甲烷（料液比1∶3）、乙酸乙酯（料液比1∶2） 等有機溶劑萃取；減壓濃縮后得到石油醚萃取相2.304 3 g、二氯甲烷萃取相0.716 0 g、乙酸乙酯萃取相0.272 0 g、水相6.844 8 g。經HPLC分析，二氯甲烷和水相片段化學成分較為單一，適合快速分離鑒定。

二氯甲烷萃取浸膏經葡聚糖凝膠柱層析，二氯甲烷∶甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到23個洗脫片段（GD1～GD23），經TLC分析，合并洗脫片段GD10～GD15和GD16～GD23，分別標記為GD10（621 mg）和GD16（351.3 mg）。GD10經正相硅膠柱層析和薄層硅膠層析分離純化，得到純度較高的片段G10-1，為化合物1。GD16經正相硅膠柱層析分離純化得到洗脫片段1～21，經TLC分析，合并洗脫片段3～5，標記為G16-3，經HPLC分離純化（HPLC條件：甲醇10%，波長254 nm；流速2 mL·min-1；洗脫時間20 min），得到純度較高的片段G16-3-2，為化合物2。

水相浸膏以甲醇溶液（0～100%）為洗脫劑，分段洗脫，經反相硅膠柱層析分離，純化得到40個洗脫片段（GOP-Z-W-1～GOP-Z-W-40）；后經HPLC分析（HPLC條件：10%～100%乙腈溶液梯度洗脫40 min，100%乙腈洗脫10 min，波長254 nm；流速1 mL·min-1），合并得到純度較高的片段GOP-Z-W-1，為化合物3，片段GOP-Z-W-18經HPLC制備得到化合物4。

將紫陀螺菌菌株進行適宜條件發酵，發酵液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取相。乙酸乙酯萃取相經HPLC（以24%甲醇30 min變梯度到80%甲醇為洗脫條件，變梯度制備）分離，得到化合物5。

1.3.3 化合物的結構鑒定

通過核磁共振譜儀對化合物1（G10-1）、化合物2（G16-3-2）、化合物3（GOP-Z-W-1）、化合物4（GOP-Z-W-18）、化合物5進行結構鑒定，分析得到各化合物的結構。

2 結果與分析

2.1 分布范圍和生長環境

紫陀螺菌主要分布在西陵峽南岸、海拔400 m～800 m的山脊及山腰中（碑埡、鮑家樁、兆吉坪一帶）。子實體為單生、叢生或者群生于林中地，且大多呈帶狀分布，長達數米。易生長在直徑20 cm以上的青岡櫟、黃櫨樹或馬尾松樹蔸附近。

2.2 發生季節與氣候特征

紫陀螺菌子實體的發生季節一般為每年的6月下旬～9月中旬（最遲可延至11月上旬），前后共發生三潮～四潮，高峰期為7月上中旬。子實體生長期間的日平均氣溫為20℃～28℃，空氣相對濕度為75%～85%。其發生量還與降雨密切相關，若長期干旱或下雨，發生量較少；晴雨交替，發生量較大。紫陀螺菌子實體生長速度緩慢，成熟期15 d～20 d，若光線較強其生長速度更慢。由此可見，紫陀螺菌子實體易生長在光線陰暗且潮濕的林地。

2.3 定點觀測結果

實地采樣的紫陀螺菌子實體見圖1。

圖1 紫陀螺菌子實體Fig.1 Fruit body of Gomphus purpuraceus

紫陀螺菌生長地多為闊葉混交林（以青岡櫟、黃櫨樹為主），林高7 m左右，林間郁閉度70%～80%。林地土壤為碳酸鹽類黃棕壤，偏酸性，pH 6.0左右，可能與其他微生物的活動、共生植物根系的分布及土壤松散多石、透氣性較好有關。

2.4 化合物的結構鑒定與分析

2.4.1 鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基） 酯

化合物1（G10-1） 為鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基）酯[phthalic acid-bis（2’-ethyl heptanyl）easter]，黃色油狀物，化學式為C26H42O4，其化學結構見圖2。

圖2 化合物1的化學結構Fig.2 Chemical structures of compound 1

化合物1的核磁共振圖譜數據如下。

1）1H-NMR（400 MHz，CDCl3）的化學位移（δ）：7.71 （2H，dd，J=3.2，5.6 Hz，H-3，6），7.53（2H，dd，J=3.2，5.6 Hz，H-4，5），4.30（4H，m，H-1′，1″），1.72 （2H，m，H-2′，2″），1.39 （20H，m，10×CH2），0.96（6H，t，J=7.6 Hz，H-b′，b″），0.90（6H，t，J=6.4 Hz，H-7′，7″）。

2）13C-NMR（100 MHz，CDCl3）的化學位移（δ）：167.7（2 × C=0），132.5（C-1，2），130.9（C-3，6），128.8 （C-4，5），68.1 （C-1′，1″），38.7 （C-2′，2″），30.4 （C-3′，3″），29.7 （C-4′，4″），28.9 （C-5′，5″），23.7 （C-6′，6″），23.0 （C-a′，a″），14.1（C-7′，7″），11.0（C-b′，b″）。

根據G10-1的碳譜、氫譜數據，與參考文獻[5]報道的譜圖數據基本吻合，由此確定化合物1為鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基）酯。

2.4.2 鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基）酯

化合物2（G16-3-2） 為鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基）酯[Bis（2-ethlhexyl）phthalate]，又稱鄰苯二甲酸二辛酯，無色透明液體，化學式為C24H38O4，其化學結構見圖3。

圖3 化合物2的化學結構Fig.3 Chemical structures of compound 2

化合物2的核磁共振圖譜數據如下。

1）1H-NMR（400 MHz，CDCl3）的化學位移（δ）：7.72 （2H，dd，J=3.4，5.7 Hz，H-2），7.52（2H，dd，J=3.4，5.7 Hz，H-3），4.26（4H，d，J=6.5 Hz，H-1′），1.77 （2H，m，H-2′），1.26 （16H，m，H-3′，4′，5′，7′），0.94 （6H，t，J=7.4 Hz，H-8′），0.88（6H，t，J=7.8Hz，H-6′）。

2）13C-NMR（100 MHz，CDCl3）的化學位移（δ）：167.8（CO），132.4（C-1），130.9（C-3），128.8 （C-2），68.2 （C-1′），38.8 （C-2′），30.4（C-3′），29.0（C-4′），23.8（C-7′），23.0（C-5′），14.0（C-6′），11.0（C-8′）。

根據G-16-3-2的碳譜、氫譜數據，與參考文獻[4]報道的譜圖數據基本吻合，由此確定化合物2為鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基） 酯。

2.4.3 D-半乳糖醇

化合物3（GOP-Z-W-1） 為D-半乳糖醇（D-galactitol），無色結晶粉末，化學式為C6H14O6，分子量182.17，其化學結構見圖4。

圖4 化合物3的化學結構Fig.4 Chemical structures of compound 3

核磁共振波譜分析數據如下。

1）1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）的化學位移（δ）：3.36（2H，m，2，5-CH），3.49（2H，m，3，4-CH），3.64（4H，m，l，6-CH2），4.18（2H，d，3，4-OH），4.29 （2H，t，2，5-OH），4.42（2H，d，1，6-OH）。

2）13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）的化學位移 （δ）：64.3（C-1，6），70.0（C-2，5），71.8（C-3，4）。

根據GOP-Z-W-1的碳譜、氫譜數據，與參考文獻[6]報道的譜圖數據基本吻合，由此確定化合物3水相GOP-Z-W-1為D-半乳糖醇。

2.4.4 腺苷

化合物 4（GOP-Z-W-18） 為腺苷 （Adenosine），又稱9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，白色或類白色結晶性粉末，化學式為C10H13N5O4，其化學結構見圖5。

圖5 化合物4的化學結構Fig.5 Chemical structures of compound 4

化合物4的核磁共振波譜分析數據如下。

1）1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）的化學位移（δ）：8.35 （1H，s，H-8），8.13 （1H，s，H-2），5.88（1H，d，J=6.4 Hz，H-1′），4.62（1H，d，J=6.0 Hz，H-2′），4.14 （1H，dd，J=2.8 Hz，J=4.8 Hz，H-3′），3.96 （1H，dd，J=12.8 Hz，J=26.4 Hz），3.68 （1H，dd，J=13.6 Hz，J=28.4 Hz，H-5′a），3.56 （1H，dd，J=3.6 Hz，J=7.9 Hz，H-5′b）。

2）13C-NMR（150 MНz，DМSО-d6）的化學位移 （δ）：156.7（С-6），152.9（С-2），149.6（C-4），140.4 （C-8），119.8 （C-5），88.4 （C-1′），86.4（C-4′），73.9（C-2′），71.1（C-3′），62.1（C-5′）。

根據GOP-Z-W-18的碳譜、氫譜數據，與參考文獻[7]報道的譜圖數據基本吻合，由此確定化合物4水相GOP-Z-W-18為腺苷。

2.4.5 吲哚-3-羧酸甲酯

化合物5為吲哚-3-羧酸甲酯（indole-3-carboxylate methyl ester），又名3-吲哚甲酸甲酯，白色結晶（甲醇），化學式為C10H9NO2，分子量175.184，其化學結構見圖6。

圖6 化合物5的化學結構Fig.6 Chemical structures of compound 5

核磁共振波譜分析數據如下。

1）1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）的化學位移（δ）：11.97（1H，brs，1-NH），8.07（1H，s，H-2），7.99（1H，d，J=6.9 Hz，H-7），7.48（1H，d，J=6.9 Hz，H-4），7.19 （2H，m，H-5，6）。

2）13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）的化學位移 （δ）：165.2（C=O），136.8（C-2），132.9（C-8），126.1 （C-9），122.8 （C-4），121.1 （C-6），120.87（C-5），112.8（C-7），106.8（C-3），51.1（-OCH3）。

根據化合物5的碳譜、氫譜數據，與參考文獻[8]報道的譜圖數據基本吻合，由此確定化合物5為吲哚-3-羧酸甲酯。

3 結論與討論

紫陀螺菌為單生或叢生，菌肉淡紫色，子實體表呈紫色，長橢圓形[9]。其生長環境潮濕，光線陰暗，常生長在青岡櫟等附近[10]。三峽地區山高林茂，地形復雜，氣候溫和適宜，是紫陀螺菌良好的生長地[11]。紫陀螺菌的生長速度慢、周期長，需要適宜的環境才能大規模培養優質菌種。此次在三峽地區調查其生長環境及分布，為以后紫陀螺菌的人工培養及開發利用提供方向，對提高珍稀野生食用菌產量、品質及保護真菌資源具有重要意義。紫陀螺菌含有蛋白質、維生素、微量元素等多種營養物質[12]，可充分利用其食用價值，提高三峽地區農民的經濟收入。國內外對紫陀螺菌化學成分的研究較少，作者對紫陀螺菌的化學成分進行深入研究，得到化合物鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基） 酯、鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基） 酯、D-半乳糖醇、腺苷、吲哚-3-羧酸甲酯。紫陀螺菌含有的化學成分中含有豐富的藥理活性[13]，加大對其化學成分的研究，提高提取工藝的精簡性，為開發藥理性保健品及研制出新的抗癌抑菌藥物提供了重要依據。