反相高效液相色譜法（RP- HPLC- ELSD）測(cè)定重組蛋白注射劑中聚山梨酯20 含量

張婷婷 魯銳 楊新磊

（安捷倫科技（中國(guó)）有限公司上海第一分公司，上海 200080）

隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，生物制劑研究著重應(yīng)用于多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、細(xì)胞生長(zhǎng)因子及單克隆抗體等領(lǐng)域。由于生物大分子具有天然的不穩(wěn)定性，因此通常將吐溫等藥用輔料添加到制劑中，以保證生物制劑的穩(wěn)定性和安全性。

聚山梨酯20 (吐溫20，Tween 20) 是一種非離子表面活性劑，具有較強(qiáng)的親水性和化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)藥物有較好的助溶作用，添加到藥物制劑中可提高其有效成分的溶解度。同時(shí)，吐溫20 能夠抑制大分子蛋白藥物的自動(dòng)聚合，提高蛋白藥物的穩(wěn)定性。目前文獻(xiàn)報(bào)道的吐溫分析方法比較多，包括HPLC-ELSD[1-2]、HPLC-DAD[3]、HPLC-CAD[4]和LCMS[5]等方法。在實(shí)際蛋白制劑的吐溫分析中，這些分析方法由于受到不同蛋白藥物的影響，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

本文建立了一種分析吐溫 20 的RP-HPLC-ELSD 方法，該方法在直接進(jìn)樣PEG 偶聯(lián)的蛋白注射劑后，即可對(duì)其中的輔料吐溫20 進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和樣品

吐溫20 購(gòu)自南京威爾藥業(yè)股份有限公司（注射級(jí)）；聚乙二醇(PEG，MW20000) 購(gòu)自JenKem Technology。三氟乙酸(TFA)為HPLC 級(jí)，購(gòu)自DikmaPure 公司；乙腈為HPLC級(jí)，購(gòu)自J.T. Baker 公司（美國(guó)）。高純水來(lái)自Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國(guó)）現(xiàn)制備。

含吐溫20 的PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑、不含吐溫20的陰性樣品和不含吐溫20 的空白輔料（含PEG 等其它輔料）均由生物制藥廠家提供。

1.2 儀器和設(shè)備

采用最高耐壓達(dá)600bar 的Agilent1260 Infinity 四元液相色譜系統(tǒng)，由以下模塊組成：

1.2.1 Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump 四元梯度泵（部件號(hào)G7104C）

1.2.2 Agilent 1260 Infinity II Multisampler 自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào)G7167A）

1.2.3 Agilent 1260 Infinity MCT 柱溫箱（部件號(hào)G7116A）

1.2.4 Agilent 1290 Infinity II ELSD 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（部件號(hào)G7102A）

利用Agilent OpenLab CDS 2.4 軟件進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)分析。

1.3 RP-HPLC 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18，3.0 mm × 150 mm, 2.7 μm，部件號(hào)683975-302 (T)

柱溫：50℃

進(jìn)樣量：10μL

流速：0.5mL/min

檢測(cè)器：ELSD

霧化溫度：50 °C

蒸發(fā)溫度：70 °C

氣體流速：1.80 SLM

流動(dòng)相A：0.1% TFA 水溶液

流動(dòng)相B：0.08% TFA 的乙腈溶液

梯度程序：時(shí)間（min）B（%）

柱后閥切換（如圖1）：0-7.5min：1-2，To Waste

圖1 柱后閥切換示意圖

1.4 SEC-HPLC 色譜條件

柱溫：30℃

進(jìn)樣量：10μL

流速：0.5mL/min

檢測(cè)器：ELSD

霧化溫度：50 °C

蒸發(fā)溫度：70 °C

氣體流速：1.80 SLM

流動(dòng)相：乙腈：20 mmol/L 甲酸銨=2：8

1.5 校準(zhǔn)曲線繪制

利用濃度范圍為10-200μg/mL 的5 個(gè)吐溫20 校準(zhǔn)標(biāo)樣，對(duì)各濃度下的平均峰面積對(duì)分析物濃度作圖，得到校準(zhǔn)曲線。

1.6 樣品前處理

方法一：取待測(cè)樣品溶液（空白輔料、陰性樣品或蛋白注射劑），過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，直接進(jìn)樣分析。

方法二：取1.0mL 待測(cè)樣品溶液到離心管中，加入1.0mL 乙腈并混勻；靜置一段時(shí)間后進(jìn)行高速離心(13200r/min，5min)；然后取上清液，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 吐溫20 的RP-LC 分析

比較了不同分離模式（SEC 和RP）對(duì)PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑中吐溫20 的分離結(jié)果。

圖2 利用AdvanceBio SEC 130。色譜柱在SEC 分離模式下PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑中吐溫20 的色譜圖

因此，本文選擇 RP-LC 方法分析吐溫 20。在Poroshell 120 SB-C18 色譜柱 (3.0 mm × 150 mm, 2.7 μm)上，吐溫20 主峰的保留時(shí)間在8.5min 左右，峰對(duì)稱性好，靈敏度高。由于吐溫20 是聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸酯的混合物，因此主峰后面還存在其它色譜峰。考慮到吐溫20 的穩(wěn)定性，我們以其中的主峰峰面積來(lái)定量分析制劑中吐溫20 的含量（建議以相同批次的吐溫20 來(lái)定量分析對(duì)應(yīng)批次的PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑）。在該色譜條件下，注射劑中的緩沖鹽未得到保留，在死時(shí)間出峰，PEG 和PEG 偶聯(lián)重組蛋白在吐溫20 后出峰，與吐溫20 分離較好。整體分析時(shí)間為20min，如圖3 所示。

圖3 利用Poroshell 120 SB-C18 色譜柱以及含TFA 的乙腈/水流動(dòng)相梯度獲得的PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑中吐溫20 的RP-LC-ELSD 色譜圖

2.2 前處理方法優(yōu)化及柱后閥切換技術(shù)的使用

由于PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射液中包含6mg/mL 蛋白質(zhì)，初始考慮優(yōu)化前處理方法以提高吐溫20 分析效率。比較蛋白注射劑過(guò)濾后直接進(jìn)樣和用有機(jī)溶劑沉淀蛋白離心后過(guò)濾進(jìn)樣所得到的結(jié)果，用乙腈沉淀蛋白質(zhì)（前處理方法二）后，吐溫20 色譜峰后仍然存在PEG 偶聯(lián)蛋白質(zhì)色譜峰，且影響吐溫20 的回收率。其可能的原因：該重組蛋白分子量較小 (19 kDa)，PEG 修飾提高了重組蛋白在高濃度乙腈條件下的穩(wěn)定性，不利于乙腈沉淀蛋白，故采用過(guò)濾后直接進(jìn)樣的方法。

考察PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑過(guò)濾后直接進(jìn)樣，吐溫20 和其它物質(zhì)在該RP-HPLC 條件下分離結(jié)果良好。但是，考慮到蛋白注射劑中包含的高濃度蛋白以及各種緩沖鹽和輔料對(duì)通用型檢測(cè)器ELSD 產(chǎn)生較重的負(fù)擔(dān)，因此在色譜柱后，進(jìn)ELSD 檢測(cè)器之前安裝一個(gè)柱后切換閥。該閥將經(jīng)過(guò)色譜柱分離的緩沖鹽（吐溫20 色譜峰之前）和重組蛋白（吐溫20 色譜峰之后）等物質(zhì)切換到廢液中，避免長(zhǎng)期分析時(shí)污染ELSD，保證整個(gè)RP-HPLC-ELSD 系統(tǒng)的穩(wěn)定性（見(jiàn)圖4）。

圖4 包含吐溫20 的PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑色譜圖：A.直接進(jìn)樣；B.經(jīng)過(guò)柱后閥切換

2.3 保留時(shí)間和峰面積的精密度

吐溫20 重復(fù)進(jìn)樣5 次得到的平均保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。保留時(shí)間和峰面積的RSD 分別為0.03%和1.33%，表明該方法具有出色的穩(wěn)定性和系統(tǒng)精密度。

2.4 檢測(cè)限（LOD）和定量限(LOQ)

將信噪比 (S/N) >3 時(shí)的最低濃度定義為L(zhǎng)OD，將S/N>10 時(shí)的濃度定義為L(zhǎng)OQ。由此計(jì)算出吐溫20 的LOD 和LOQ 分別為5μg/mL 和10μg/mL。當(dāng)吐溫20 進(jìn)樣濃度為10 μg/mL ，進(jìn)樣量為10 μL 時(shí)，S/N 達(dá)到24，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 S/N >10 的要求（如圖 5 所示）。這表明采用RP-HPLC-ELSD 方法的靈敏度很高，可以滿足客戶分析蛋白注射劑中低濃度吐溫20 含量的要求（樣品中吐溫20 含量40μg/mL 左右）。

圖5 濃度為L(zhǎng)OQ 的吐溫20 的色譜圖

2.5 線性分析

在濃度范圍10-200μg/mL 之間，使用峰面積的對(duì)數(shù)與吐溫20 濃度的對(duì)數(shù)繪制校準(zhǔn)曲線Log (y)=1.7673Log(x)-1.2237，相關(guān)系數(shù)(r) 大于0.999，表明該方法在該濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

3 實(shí)際樣品分析

對(duì)客戶提供的已知吐溫20 準(zhǔn)確含量(40μg/mL)的重組蛋白注射劑和空白輔料溶液以及不含吐溫20 的陰性樣品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6 所示。蛋白注射劑和空白輔料溶液中的吐溫20 含量分別為 40.4μg/mL 和38.9μg/mL，分析準(zhǔn)確度滿足要求（客戶要求偏差在±10%內(nèi)）。

圖6 樣品色譜圖：A. 含吐溫20 的蛋白注射劑；B.20μg/mL 吐溫20 標(biāo)準(zhǔn)溶液；C.不含吐溫20 的陰性樣品溶液；D.含吐溫20 的空白輔料溶液

4 結(jié)論

本文介紹了一種對(duì)實(shí)際PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射液中吐溫 20 進(jìn)行高效分離的方法。該方法采用 Agilent 1260 Infinity II 四元液相色譜系統(tǒng)、1290InfinityⅡELSD 檢測(cè)器和Poroshell 120 SB-C18 色譜柱。1290InfinityⅡELSD 為吐溫20 提供了較高的檢測(cè)靈敏度和較好的精密度結(jié)果。吐溫20 的LOD 和LOQ 分別為5μg/mL 和10μg/mL，在10-200 μg/mL 濃度范圍表現(xiàn)出良好的線性，且實(shí)際樣品的測(cè)定值在理論值的±10%范圍內(nèi)，表明該方法可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析。針對(duì)客戶測(cè)定實(shí)際重組蛋白制劑（如偶聯(lián)PEG）中吐溫20 的分析需求，本文所述的方法可作為一種可靠的解決方案。