氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法同時測定乳粉中22種鄰苯二甲酸酯

王金翠，王晰銳

（1.黑龍江省天潤檢驗檢測研究院有限公司，黑龍江哈爾濱 150009；2.黑龍江省藥品審核查驗中心，黑龍江哈爾濱 150001）

鄰苯二甲酸酯類（Phthalate Esters，PAEs）為鄰苯二甲酸的酯化衍生物，是目前使用最普遍的一類增塑劑和軟化劑，自20世紀初，PAEs就廣泛地在酒類、油脂、乳制品、兒童食品等各類食品及食品包裝材料中檢出，同時在人體脂肪、血清、毛發中也曾檢出DBP、DEHP等PAEs類物質[1?2]。有文獻指出，PAEs不僅會危害人體免疫以及消化系統[3?4]，損害動物及人類生殖系統[5?6]，大劑量攝入還會對動物產生致畸和致突變作用[7?8]，更有動物實驗曾驗證DBP會產生致DNA損傷的危害[8]。

目前，DBP、DEP、DEHP、DMP、DOP及BBP已被美國環保總局列入“優先污染物名單”；歐盟（2004/73/EC）公告也將DBP、DEP列為第2類生殖毒性化合物[9]，針對鄰苯二甲酸酯類污染，我國2011年出臺的《衛辦監督函〔2011〕551號》已規定食品、食品添加劑中的DBP、DEHP及DINP的最大殘留量分別為0.3、1.5、9 mg/kg。在對PAEs類污染物進行監測的過程中發現，油脂及其制品、乳及乳制品等脂溶性較強，在生產、加工、儲運過程中接觸塑料管道或塑料包裝的食品，易通過浸泡、摩擦、溶解等物理或化學作用存在較大的遷移風險，在溫度較高、接觸時間較長等情況下更易發生PAEs遷移[10?13]。

食品中鄰苯二甲酸酯類物質檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）等[14?17]。相對于質譜方法，GC和HPLC法存在定性能力不足的問題，且在檢測通量方面存在較大局限性[18?19]，LC-MS/MS法常常存在本底干擾，系統空白較難控制，GC-MS是目前較為常用的測定方法[20]。然而，在GC-MS檢測過程中發現大多數鄰苯二甲酸酯類化合物都存在一個相同的碎片離子，其余離子碎片響應值都較低[21?23]，用于成分較復雜的乳粉等樣品檢測時存在檢測方法靈敏度不高、專屬性不強等問題[24?26]。而相對于GC-MS，GC-MS/MS具有的多反應監測（MRM）模式，不僅具有更好的專屬性，也能夠在很大程度上降低復雜樣品基質干擾，提高檢測靈敏度[27]。本研究以乳粉為研究對象，利用鹽析的原理以液液萃取的方式提取PAEs，樣品制備過程簡單，結合GC-MS/MS檢測方法，建立一種靈敏度更高、專屬性更強的乳粉中PAEs檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳粉 市售嬰幼兒乳粉（一段）；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯 色譜級，德國Fisher公司；氯化鈉

優級，科密歐；鄰苯二甲酸酯 標準品，德國Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司：鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二烯丙酯（DAP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸二丙酯（DPrP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP） 標準品，純度均為99.0%；鄰苯二甲酸二異丙酯（DIPrP）、鄰苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（DBEP） 標準品，純度均為98.5%；鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二異戊酯（DIPP）、鄰苯二甲酸二環己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（DPhP）、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP） 標準品，純度均為99.5%；鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP） 純度94.0%；鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（BMPP） 純度98.0%；鄰苯二甲酸二戊酯（DPP） 純度99.2%；鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP） 純度97.0%；鄰苯二甲酸二己酯（DHP）

純度98.2%；鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP） 純度97.5%；水 屈臣氏蒸餾水。

GCMS-7000D氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（配電子轟擊離子（EI）源） 安捷倫有限公司；3-18K臺式低溫離心機 德國SIGMA公司 ；MS105DU電子天平 德國梅特勒公司；Talboys渦旋混合器上海安譜實驗科技股份有限公司；KQ5200DE超聲振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；WS21水浴振蕩搖床 德國WIGGENS；NRY-100C空氣振蕩搖床

上海培因實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳粉中PAEs的提取 稱取混合均勻的乳粉試樣2.00 g置于25 mL具塞玻璃離心管中，加入5 mL水，5 g氯化鈉，待分散混勻后，再加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取（200 W）10 min后4000 r/min下離心5 min，收集上清液。再向殘渣中加入10 mL乙腈重復提取一次后合并上清液于另一玻璃離心管中。將上清液于40 ℃氮吹至近干，加入5 mL乙腈渦旋清洗管壁，再繼續吹至近干，用2 mL乙腈復溶，放入?18 ℃冰箱冷藏2 h，10000 r/min低溫（4 ℃）離心5 min，取上清液，即為待測樣品溶液。

1.2.2 空白樣品基質溶液及基質標準溶液的配制取不含鄰苯二甲酸酯類化合物的乳粉樣品，按照樣品前處理方法，制成空白樣品基質溶液。用乙腈溶解鄰苯二甲酸酯類標準品，配制成濃度為1.0 mg/mL的單標儲備液，吸取一定體積單標儲備液，用乙腈稀釋成濃度為1.0 μg/mL的混合標準溶液，再用空白基質溶液稀釋成系列混合標準溶液（5、10、50、100、500 ng/mL）。

1.2.3 GC-MS/MS條件

1.2.3.1 氣相色譜條件 色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL/min；升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min升至160 ℃ ，保持2 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至280 ℃，保持 5 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持2 min；進樣量：1 μL，不分流進樣；進樣口溫度為250 ℃；溶劑延遲：4 min。

1.2.3.2 質譜條件 離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；淬滅氣：高純氦氣，2.5 mL/min；碰撞氣：高純氮氣，1.5 mL/min；采集模式：多反應監測（MRM），鄰苯二甲酸酯類化合物MRM采集參數見表1。

表1 22種鄰苯二甲酸酯類化合物MRM參數Table 1 MRM parameters of 22 PAEs

1.3 數據處理

采用外標法進行定量，以控制變量法優化實驗條件，通過標準加入法，計算目標物質加標回收率進行結果評價。使用儀器配套工作站MassHunter 以及Microsoft Excel 2020進行數據處理，每個實驗重復進行3次，取均值進行分析。

2 結果與分析

2.1 實驗本底的控制

鄰苯二甲酸酯類廣泛存在于環境及各類實驗耗材中，因此實驗室必須進行本底值的控制和系統評價。所用的有機試劑應為色譜級或質譜級，無機試劑需要經過高溫烘烤（200 ℃，2 h）；在實驗過程中避免使用任何未經本底考察的塑料制品；玻璃器皿使用前應洗凈，先以丙酮浸泡2 h，再置于干燥箱干燥（100 ℃，12 h），冷卻后使用；使用過程中避免使用尼龍材質濾膜；檢測樣品的同時，需做兩次試劑空白試驗，取其平均值作為系統本底值，當實驗室的系統空白小于方法檢出限的三分之一時，本底值可忽略不計，否則應扣除空白值。

2.2 乳粉中PAEs提取條件的優化

以市售乳粉為測試樣品，以加標回收方式，在40 μg/kg加標水平下，考察正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇四種經初步篩選的溶劑對PAEs的提取效率，結果發現（圖1），乙腈提取效率最高，22種PAEs回收率在84.5%~109.1%之間，乙酸乙酯提取回收率最低，為67.3%~104.2%。這可能是由于乳粉中存在較多的脂溶性物質，而正己烷、乙酸乙酯易與油脂互溶，導致過多脂溶性雜質被溶出，產生較大基質干擾，此外，正己烷、乙酸乙酯均為弱極性溶劑，對中等極性的PAEs提取效果不佳；以乙腈、甲醇為溶劑，由于其脂溶性較弱，基質干擾較小，通過檢驗數據還可以發現，相比于甲醇，乙腈對PAEs具有更好的提取效率，四種提取溶劑回收率大小順序為乙腈>甲醇>正己烷>乙酸乙酯。

圖1 提取溶劑對PAEs回收率的影響Fig.1 Effects of extraction solvents on the recoveries of PAEs

本研究還對PAEs提取方式和提取時間進行了考察，分別以水浴振蕩、空氣振蕩、超聲提取，圖2結果表明，超聲提取22種PAEs回收率在84.5%~109.1%之間，水浴振蕩提取回收率在83.8%~104.4%之間，而空氣振蕩提取回收率在80.4%~101.0%之間，超聲提取方式加標回收率最高，并且相比超聲提取10 min，超聲提取15 min時提取效率并未有明顯提高，因此，確定以乙腈為提取溶劑，超聲提取10 min為乳粉中PAEs最優提取條件。

圖2 提取方式對PAEs回收率的影響Fig.2 Effects of extraction methods on the recoveries of PAEs

2.3 基質效應的考察

GC-MS/MS殘留分析中普遍存在基質效應，多表現為基質增強效應，通過以空白基質樣品溶液配制標準溶液，與同濃度純溶劑（乙腈）配制標準溶液的響應值進行比對，以ME值評價基質效應，ME=（空白基質中待測物的響應值/乙腈中待測物的響應值），ME<0.85評價為基質抑制，ME>1.15評價為基質增強效應，0.85≤ME≤1.15則認為其基質效應較小[28]。結果發現，22種待測物ME值均大于1，僅5種待測物表現為較小的基質效應，其余17種待測物在基質中均存在基質增強效應，因此，以純溶劑曲線進行校準會產生較大的偏差，需要以基質匹配標準曲線進行校準，用以消除基質效應，保證定量結果的準確性，具體結果如圖3所示。

圖3 乳粉中22種鄰苯二甲酸酯類的基質效應Fig.3 Matrix effects of 22 phthalate esters in milk powder

2.4 GC-MS/MS分析參數優化

采用鄰苯二甲酸酯含量均為1 μg/mL的單組分標準品溶液，以全掃描方式分別對22種目標化合物進行全掃描，結合NIST譜庫檢索結果確定各自的保留時間。在單離子掃描模式（SIM）下，根據所獲得的一級質譜圖選取質荷比較大、信號響應較強的1~2離子碎片作為母離子完成第一次篩選；再以不同的碰撞能（5~40 V）使一級篩選下獲得的母離子斷裂，形成子離子，為每個母離子選取1~2個信號響應強的離子作為子離子，完成目標物的二級質譜條件篩選。以其中強度較大的離子對作為定量離子對，另一個則作為定性離子對，22種化合物的保留時間及質譜采集參數如表1所示。

在研究過程中發現，雖然大多數PAEs僅有一個較大的分子量為149的碎片離子，而二級質譜（GC-MS/MS）獨有的多反應監測（MRM）模式，可將149作為母離子，在一定碰撞能量下繼續斷裂生成子離子，經過兩次篩選，避免了一級質譜SIM采集模式下大多數鄰苯二甲酸酯類物質均以149作為離子碎片所引起的檢測方法專屬性不好、選擇性較差的問題，進而提高了檢測的靈敏度。

2.5 線性范圍、檢出限、定量限、準確度與精密度

方法的線性范圍、相關系數、檢出限、定量限、回收率及相對標準偏差結果見表2。基于能顯示基線噪聲的分析方法，以加標樣品中目標物定量離子對信噪比3倍為檢出限，在取樣質量為2 g，樣品終體積為2 mL的條件下計算方法的檢出限，22種鄰苯二甲酸酯化合物方法檢出限在1~5 μg/kg之間；通過對基質標準溶液的線性關系考察，發現在5~500 ng/mL范圍內，各物質線性關系良好，相關系數均大于0.99；以市售乳粉為測試樣品，以上述優化后的方法，通過加標回收的方式考察方法準確度和精密度，22種鄰苯二甲酸酯類化合物，在20 μg/kg的加標水平下，回收率在82.4%~111.4%之間，在40 μg/kg的加標水平下，回收率在84.5%~109.1%之間，在100 μg/kg的加標水平下，回收率在90.6%~103.7%之間，每個加標水平進行6次平行測定，全部組分相對標準偏差均小于10%。

表2 線性方程、相關系數、檢出限、定量限、回收率與相對標準偏差（n=6）Table 2 Linearity, correlation coefficient (r), limits of detection (LOD), limits of quantitations (LOQ), recovery and relative standard deviation (RSD) (n=6)

3 討論與結論

本研究將樣品用水溶解后以乙腈為溶劑提取乳粉中的PAEs，以GC-MS/MS的MRM模式進行檢測，本方法樣品制備過程簡單，很大程度上減少了實驗室前處理過程及耗材帶來的本底污染，以空白基質配制標準曲線很大程度降低了基質效應，22種PAEs在20~100 μg/kg加標水平下，回收率在82.4%~111.4%之間，符合GB/T 27404-2008[29]對檢驗方法回收率的要求（80%~120%），該法不但能夠有效降低樣品基質干擾，提高乳粉中PAEs檢測靈敏度，而且前處理過程快速便捷，可以減少樣品前處理過程中鄰苯二甲酸酯類物質的引入，是一種高效便捷、靈敏度高、穩定性好的乳粉中鄰苯二甲酸酯類物質的檢測方法。