載原花青素的魔芋葡甘聚糖微粒的制備、表征及體外釋放性能評價

王朦朦，謝 勇，蔡夢思，衛子顏，劉 雄

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

膳食結構的改變可直接影響結腸疾病的發生與發展[1]，通過調節膳食結構預防腸道疾病在目前正受到廣泛關注。原花青素（proanthocyanidins, PC）作為一類常見的多酚類物質，其強抗氧化性使它能夠清除自由基，預防癌癥、心腦血管等疾病[2?3]。同時，研究發現PC在結腸類疾病的預防中也有著巨大潛力[4]：PC可抑制結腸癌細胞的增殖并促進其凋亡[5]；動物在食用富含PC的食物后，其結腸中具有抗炎活性的代謝物顯著增加，炎癥癥狀明顯減輕[6]。然而，由于PC主要在小腸被吸收，且穩定性較差，易被消化液破壞，難以作用于結腸部位[7]。因此，可以利用包封技術提高PC的穩定性，避免PC在上消化道中被分解和吸收，從而實現結腸靶向遞送。目前，對PC進行保護的方法包括利用微膠囊、凝膠等對其進行包封，如吳曉瓊等[8]利用殼聚糖水凝膠對PC多重乳液進行包裹，紀秀鳳等[9]以明膠和阿拉伯膠為壁材，通過復凝聚法制備紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊增加PC穩定性。但這些包封技術存在制備工藝復雜、包封材料性能差、需要其它添加劑的協調作用等不足。因此，需要在這些方面對PC的包封進一步研究改善。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）作為一種天然高分子多糖，因其生物安全性和特殊的抗消化性，往往被認為是包封材料的良好選擇[10?11]。同時，KGM具有預防腫瘤癌變[12]、抗氧化自由基、改善腸道生態[13]等諸多作用，在預防腸道疾病方面也有著良好的應用前景。因此，將KGM作為包封材料應用于PC的靶向遞送，不僅可以使PC實現結腸靶向緩釋的目的，也可在一定程度上利用KGM改善腸道功能的功效。隨著KGM作為包封材料的研究不斷深入[11,14]，其溶脹度高、粘度大、凝膠可塑性弱、溶膠穩定性差等缺陷，使它往往需要通過物理和化學改性加以改進。如CHEN等[15]將KGM與丙烯酸共聚形成水凝膠，可以使模型藥物釋放受水凝膠腫脹和降解控制；SHI等[16]以羧甲基KGM和2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖為載體，靜電絡合法制備了新型復合納米球。雖然這些技術取得了一定的效果，但這些改性技術工藝復雜，生產成本較高，且在食品安全方面面臨著不少挑戰。因此，需要探索一些綠色、安全的KGM包封技術，來降低生產成本，并增加PC的食品安全性。

目前，關于KGM包封PC的研究鮮有報道，尋找簡單易操作的KGM包封技術成為亟待解決的工業問題。因此，本文探究了一種新的KGM包封技術，即利用KGM在乙醇體系下吸水微溶脹的特性，在乙醇溶液中用KGM對PC進行吸附包封。實驗通過單因素及正交試驗優化KGM/PC微粒的制備工藝，利用粒徑分析、掃描電鏡、紅外光譜等對微粒的性質進行表征，從而確定該方法下KGM能成功包封負載PC。同時，通過模擬體外消化評估了KGM/PC微粒的緩釋性能，以期為其在結腸控釋方面的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

純化魔芋精粉（純度≥86%） 湖北十堰花仙子魔芋制品有限公司；原花青素（純度≥95%） 原葉生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥250 U/mg）、胰酶（4×USP） 美國Sigma-Aldrich公司；β-甘露聚糖酶（40000 U/g） 北京索來寶科技有限公司；其他化學試劑 均為國產分析純。

AXTG16G型醫用離心機 鹽城市安信實驗儀器有限公司； LGJ-10型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；TU-1950雙光束紫外可見分光光譜儀 北京普析通用儀器有限責任公司；S-3000N型掃描電鏡 HITACHI公司；Mastersizer 3000型激光粒度分析儀 英國馬爾文公司；Spectrum 100紅外光譜儀 美國PerkinElmer 公司； SHZ-88型水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 KGM/PC微粒的制備工藝優化

1.2.1.1 載PC的KGM微粒的制備 稱取一定量的PC，于室溫下加入到25 mL一定濃度的乙醇水溶液中，待PC完全溶解，加入一定量的KGM，磁力攪拌15 min后，經離心（1500 r/min）10 min，棄去上清液，用同濃度乙醇溶液清洗3遍，再次離心，取沉淀物冷凍后真空冷凍干燥12 h后，獲得KGM/PC微粒。

1.2.1.2 單因素實驗 按1.2.1.1中的方法制備KGM/PC微粒，選取KGM添加量（14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%）、KGM粒徑（粒徑分為5個等級，由1~5分別對應的粒徑范圍為210~250、170~210、130~170、90~130和50~90 μm）、乙醇濃度（10%、12%、14%、16%、18%、20%）及PC添加量（5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%）4個因素進行單因素實驗，選擇20%的KGM添加量、50~90 μm的KGM顆粒、14%乙醇濃度和7%的PC添加量為各單因素的控制變量。探究各因素對KGM/PC微粒負載率的影響，每個因素平行實驗3次，取平均值。

1.2.1.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，選取乙醇濃度、KGM添加量和PC添加量為考察因素，以KGM/PC微粒的負載率為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗設計，確定KGM/PC微粒的最佳制備條件。因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.1.4 KGM/PC微粒的負載率的測定 取20 mg制備好的KGM/PC微粒加入20 mL的β-甘露聚糖酶液（5 mg/mL）中，37 °C水浴保溫并磁力攪拌1 h，待KGM/PC微粒完全酶解，混勻后取2 mL于離心機經離心（1500 r/min）10 min后，用硫酸-香草醛比色法[17]測量上清液中原花青素含量，并用公式（1）計算PC的負載率：

式中：m為KGM/PC微粒中PC的含量，mg；M為KGM/PC微粒的總質量，mg。

1.2.2 KGM/PC微粒的表征

1.2.2.1 顆粒粒徑測定 參考畢會敏等[18]的方法并作適當修改，采用英國馬爾文公司的Mastersizer 3000型激光粒度分析儀測定載藥微粒的粒徑分布，以無水乙醇為分散系，折射率為1.52，折光度范圍：8%~20%。

1.2.2.2 顆粒表觀形態及結構特征 將KGM負載PC前后的顆粒樣品置于培養皿中，用相機拍攝顆粒的表觀形態；用研缽充分研磨KGM負載PC前后的顆粒樣品從而破壞顆粒表面結構，將研磨前后的樣品顆粒固定在雙面導電膠上，在真空下對樣品進行離子濺射噴金處理，用電子掃描顯微鏡（SEM）在500×,5000×下對顆粒的表面形態進行觀察，并選擇合適的區域拍照。

1.2.2.3 傅立葉紅外光譜分析 參考YAN等[19]的方法，將KGM、PC、KGM-PC混合物和KGM/PC微粒分別使用傅立葉變換紅外光譜儀在4000~600 cm?1范圍內檢測，累積掃描次數為32。

1.2.3 KGM/PC微粒體外釋放性能的測定

1.2.3.1 人工模擬消化液的配制 參照ANA-ISABEL等[20]的方法并作適當修改，制備胃模擬消化液（簡稱胃液，pH2.0）和小腸/結腸模擬消化液（簡稱腸液，pH7.4）。模擬消化前，在胃液中加入胃蛋白酶，配制成胃蛋白酶液（10 mg/mL）備用；在腸液中分別加入胰酶和β-甘露聚糖酶配制成胰酶液（10 mg/mL）和β-甘露聚糖酶液（10 mg/mL）備用。

1.2.3.2 體外消化及PC釋放率的測定 參考文獻[20?22]的方法并作適當修改，將0.1 g KGM/PC微粒用1 mL去離子水溶解形成凝膠后，置于 90 mL人工模擬液胃液中，添加胃蛋白酶液10 mL并密封，然后于恒溫振蕩器中消化4 h（37 ℃，175 r/min）。胃消化結束后，用1 mol/mL的NaHCO3調節體系pH7.4，并添加80 mL模擬腸液和20 mL胰酶液，密封后于恒溫振蕩器（37 ℃，175 r/min）繼續消化4 h。待胃部和小腸模擬消化后，向小腸消化體系中加入20 mLβ-葡甘聚糖酶液，于恒溫振蕩器（37 ℃，175 r/min）中再消化8 h以模擬微粒在結腸環境中的釋放情況。整個體外消化過程中，制備間隔1 h的不同時間段的反應體系，待反應時間結束，從消化體系中取1 mL混合液于2 mL PE離心管中，并將剩余反應體系沸水浴5 min以鈍化酶的活性。取出的樣液則經離心（1500 r/min）10 min后，取上清液測定PC的釋放率，PC釋放率用公式（2）計算。同時，按照KGM/PC中PC的含量，將未包封的PC與KGM均勻混合后，按照以上步驟進行消化，作為對照實驗。

式中：Ct為t時間內釋放液中PC的含量，mg；C為體外釋放前KGM/PC微粒中PC的含量，mg。

1.3 數據分析與處理

所有實驗數據統計分析均用SPSS 25.0進行方差分析，Origin 8.5作圖，所得結果均以3個獨立樣本的平均值±標準偏差表示，Duncan式檢驗法（P<0.05）判定其顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 KGM/PC微粒的制備優化

2.1.1 單因素實驗結果 乙醇濃度、PC添加量、KGM添加量和KGM粒徑對KGM/PC微粒負載率的影響結果如圖1所示。由圖1可知，KGM/PC微粒的負載率隨KGM添加量的增加，呈現先穩定后降低的趨勢。由于KGM在固定乙醇濃度和PC添加量的體系下吸水率不變，單位KGM可裝載的PC量不變，微粒負載率無顯著變化。當KGM添加量到達18%以后，體系內PC的量不變，KGM分子之間相互競爭，導致微粒負載率下降。因此，確定正交試驗中KGM添加量的水平分別為16%、18%和20%。隨著PC添加量的增加，KGM/PC微粒負載率先增加后穩定。可能是KGM顆粒內部可裝載PC的空間有限，當PC添加量增加到10%后，KGM負載PC的量趨于飽和；且實驗得出該體系下PC的最大添加量為11%。故確定正交試驗中PC添加量的水平分別為9%、10%和11%。KGM/PC微粒的負載率隨乙醇濃度的增加而下降。由于PC隨KGM吸收水分時進入KGM顆粒內部，乙醇作為溶脹抑制劑降低了KGM的吸水率[23]，隨著乙醇濃度的增加，KGM的吸水率下降，導致KGM/PC微粒的負載率隨之減??；且實驗發現當乙醇濃度小于10%，凍干后無法獲得顆粒態微粒。綜上，確定正交試驗中乙醇濃度的水平分別為10%、12%和14%。粒徑變化對KGM/PC微粒的負載率無顯著性影響。隨著KGM顆粒粒徑的降低，KGM的吸水性會顯著增加[24]，理論上來講，微粒負載率應隨著KGM粒徑的降低而增大。實踐中由于乙醇對KGM吸水性有較強的抑制作用，該作用程度大于粒徑對KGM吸水性的影響程度，限制KGM吸水溶脹，而不表現出負載率的顯著變化。因此，正交試驗時不考慮此因素。

圖1 KGM添加量、PC添加量、乙醇濃度和KGM粒徑對KGM/PC微粒負載率的影響結果Fig.1 The results of amount of KGM and PC added, alcohol concentration and KGM particle size on the loading rate of KGM/PC particles

2.1.2 正交試驗結果 在單因素實驗結果的基礎上進行正交試驗，確定KGM/PC微粒的最佳制備條件。得到正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。由表3可知，因素A、B對KGM/PC微粒負載率的影響顯著（P<0.05），因素C為不顯著因素，由F值大小確定各因素對微粒負載率的影響大小順序：A>B>C。結合表2得到KGM/PC微粒的最佳制備條件為A1B3C1。該制備條件在正交試驗中未出現，不能確定此組合是否為最佳工藝，因此需要進行驗證實驗，在A1B3C1條件下進行平行實驗，得到平均負載率為（14.75%±0.27%），高于其他組的負載率，說明乙醇濃度10%、PC添加量11%、KGM添加量16%為相對最佳工藝。同時，對比相似研究發現，該方法下制備得KGM/PC微粒的負載率高于SUSANTI等[23]采用泡沫墊干燥法對富含PC的紅高粱提取物進行包封（PC含量為9.11~9.23 mg/g）；與葛瑩瑩等[25]制備的石墨烯/KGM多孔干凝膠的負載率相近，該凝膠對5-氟尿嘧啶的負載率達到154 mg/g。說明該制備方法不僅簡單有效，還可以獲得較高負載量的微粒。

表2 KGM/PC微粒負載率正交試驗設計與結果Table 2 The orthogonal experimental design and results for loading rate of KGM/PC particles

表3 KGM/PC微粒負載率正交試驗方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal test for loading rate of KGM/PC particles

2.2 KGM/PC微粒的表征

2.2.1 KGM顆粒負載PC前后的粒徑變化 KGM顆粒負載PC前后粒徑的變化情況如圖2所示，KGM和KGM/PC 微粒的粒徑圖均為單峰分布曲線，兩者粒徑主要分布在40~170 μm之間。與未負載PC的KGM顆粒對比，KGM/PC微粒的Dx（10）、Dx（50）和Dx（90）值均明顯增加，比表面積由78.4 m2/Kg減小為59.03 m2/Kg。說明KGM顆粒負載PC后體積增大，這可能是由KGM吸水溶脹過程中PC隨水分進入KGM，凍干后水分升華，PC保留在KGM顆粒內部所導致的。

圖2 KGM顆粒負載前后的粒徑變化Fig.2 The change of KGM particle size before and after loading

2.2.2 KGM顆粒負載PC前后的顆粒表觀形態及結構特征 KGM顆粒負載PC前后的顆粒表觀形態如圖3所示。由圖3可知，KGM顆粒表觀呈白色顆粒狀，PC為紅褐色粉末，KGM/PC微粒呈淺紅褐色顆粒狀，而按相同比例混合制備的KGM-PC混合物為白色和紅褐色相間的顆粒狀，說明乙醇體系下KGM能夠負載PC，從而形成均勻的KGM/PC微粒。

圖3 KGM顆粒負載前后的表觀形態圖Fig.3 The apparent morphology of KGM particles before and after loading

KGM顆粒負載PC前后的結構特征如圖4所示。KGM顆粒負載PC前后表觀狀態無明顯變化，均呈表面平整的不規則顆粒狀。進一步研磨破碎顆粒表面，發現KGM顆粒微觀結構呈現較完整的排列有序的片層纖維結構，這與唐蘭蘭等[26]的研究結果一致。但KGM/PC微粒顆粒內部具有大量網狀多孔洞結構，可能是由于KGM顆粒在低濃度乙醇溶液中吸水微溶脹，冷凍干燥過程中內部水分升華形成的。同時，這些孔洞結構可以為KGM包封PC提供空間基礎，也說明了KGM顆粒負載PC后體積增大的原因。

圖4 KGM顆粒負載前后的掃描電鏡圖Fig.4 The scanning electron micrographs of KGM particles before and after loading

2.2.3 傅立葉紅外光譜分析 圖5為KGM、PC、KGM/PC微粒和KGM-PC混合物的紅外圖譜，KGMPC混合物的紅外譜圖顯示了來自KGM的各特征吸收峰，同時在1605.76、1519.91、1437.04 cm?1處檢測到三個連續的吸收峰，這是來自PC苯環骨架中的C=C特征伸縮振動峰[27]，在1279.97、1208.42 cm?1處檢測到PC的酚羥基伸縮振動及面內彎曲振動峰，表明該混合物中KGM與PC二者只存在單一混合。KGM/PC微粒紅外圖譜中的特征吸收峰主要是KGM的各吸收峰，但在1520.93 cm?1左右出現了一個PC苯環骨架C=C的特征伸縮振動峰，說明該微粒中含有PC；而PC的其他特征吸收峰未出現，說明微粒并不是壁材與芯材的簡單物理混合物[28]。并且在形成的微粒中未發現新的特征吸收峰，說明在制備過程中未形成新的化學鍵，KGM與PC之間并未發生化學反應[29]。上述結果表明，KGM成功將PC進行了包封，且在該反應過程中未改變KGM和PC的化學性質。結合粒徑與掃描電鏡的結果，推測PC隨KGM的吸水過程進入KGM顆粒內部，凍干后附著在KGM顆粒內的孔洞結構中，從而達到KGM負載PC的效果。

圖5 KGM、PC、KGM-PC混合物和KGM/PC微粒的紅外譜圖Fig.5 The FT-IR spectra of KGM, PC, KGM-PC mixture and KGM/PC particles

2.3 KGM/PC微粒的體外緩釋性能

KGM/PC微粒體外緩釋測定實驗的結果如圖6所示。經胃部和小腸模擬消化后，KGM-PC混合凝膠和KGM/PC微粒凝膠中PC的釋放率分別為32.46%和 20.53%，微粒凝膠較混合凝膠降低了36.75%的釋放率。PC釋放差異性的原因可能與KGM-PC混合粉和KGM/PC微粒形成的凝膠結構有關，當KGM/PC微粒吸水形成凝膠時，由于PC被包封于KGM內部，不影響KGM與水分子和KGM分子以氫鍵結合形成凝膠[30]，而在 KGM-PC混合體系中PC在一定程度上會阻礙KGM分子間的締合，從而影響凝膠結構的形成。所以微粒凝膠結合更牢固，在胃部和小腸階段的PC釋放率更低。

圖6 KGM/PC微粒和KGM-PC混合物的體外緩釋結果Fig.6 The in vitro sustained release results of KGM/PC particles and KGM-PC mixture

在模擬結腸消化階段，KGM/PC微粒凝膠和KGM-PC混合凝膠分別于8和7 h后達到完全釋放，對比凝膠在模擬胃部和小腸階段的釋放情況，發現模擬結腸環境中PC的釋放速度更快，這主要是因為結腸環境中的β-甘露聚糖酶具有降解KGM的特性[31]，從而促進了PC的釋放。同時，凝膠表面附近的PC主要通過KGM吸水溶脹過程中形成的水孔或通道擴散，KGM的酶降解在一定程度上導致了新孔的出現，網絡部分受損，孔徑增大，使得PC的釋放速率進一步增加[32]。綜上所述，KGM/PC微粒凝膠經過胃部和小腸消化后，還有80%左右的PC可到達結腸部位釋放，因此判斷微粒可以起到結腸靶向的作用。

3 結論

本實驗通過正交試驗確定KGM/PC微粒的最優制備工藝為：乙醇濃度10%、PC添加量為11%、KGM添加量為16%，在該條件下可得到負載率為（14.75%±0.27%）的KGM/PC微粒，并以粒徑、表觀結構及紅外光譜分析證實了在乙醇體系下利用KGM吸水微溶脹特性制備優良KGM/PC微粒的可行性。同時，利用體外模擬消化實驗確定該KGM/PC微粒具有較好的體外緩釋性能，可為PC的結腸靶向遞送提供借鑒意義。本實驗制備的KGM/PC微粒的工藝相比于文中提到的其它方法（復凝聚法、泡沫墊干燥法等）更簡單，且無需對KGM進行改性處理，從而確保了KGM/PC微粒的食品安全性，可為工業生產提供一種簡單有效、安全風險更低、生產成本更小的包封技術。