響應面法優(yōu)化秋刀魚酶解制備抗氧化活性肽的工藝

欒俊家，張尚悅 ，李昂達，李學鵬, ，勵建榮，林 洪，王明麗，郭曉華，于建洋，周小敏

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，國家魚糜及魚糜制品加工技術研發(fā)分中心，遼寧錦州 121013；2.海軍大連艦艇學院航海系，遼寧大連 116018；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266100；4.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東煙臺 265600；5.山東美佳集團有限公司，山東日照 276815；6.榮成泰祥食品股份有限公司，山東威海 264300；7.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江舟山 316120）

秋刀魚（Cololabis saira）隸屬于頜針魚目（Beloniformes）、竹刀魚科（Scomberesocidae）、秋刀魚屬（Cololabis Gill），是中上層魚類，主要分布于北太平洋海域[1?2]，中國則主要分布在山東東岸和黃海兩個海域。近年來我國秋刀魚年漁獲量達到9萬噸左右[3]。隨著捕獲量的增加，秋刀魚的加工利用逐漸引起人們的關注。MORI等[4]首次從秋刀魚魚鱗中純化鑒定出Ⅰ型膠原蛋白。陳建文等[5]發(fā)現秋刀魚酶解產物中含有大量具有較高營養(yǎng)價值的氨基酸，具有良好的營養(yǎng)保健功能。趙謀明等[6]應用響應面法優(yōu)化分析了酶解秋刀魚制備黃嘌呤氧化酶抑制肽的工藝條件。

海洋魚蛋白源抗氧化活性肽可以通過不同的途徑清除外源性和內源性自由基，且具有結構復雜、種類多、活性強和副作用少等優(yōu)勢。目前，抗氧化活性肽有多種制備方法[7?10]。蛋白酶水解法與其它方法相比，條件溫和、成本較低、過程可控且副產物較少，目前被廣泛應用[11?12]。從魚皮明膠酶解液中分離純化出的Gly-Pro-Y型和X-Hyp-Gly型肽段具有較高的抗氧化活性，且能夠顯著改善DSS誘導的小鼠結腸炎的臨床癥狀[13]。從藍鰭金槍魚頭酶解液中分離純化出的三種肽段（Trp-Glu-Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Pro和Gly-Val-Pro-Leu-Thr），經測定具有較高的抗氧化活性[14]。

鑒于此，本文以秋刀魚肌肉為原料，采用酶解法制備抗氧化活性肽。首先從六種商用蛋白酶中篩選出合適的蛋白酶，在此基礎上，通過單因素實驗和響應面試驗方法對秋刀魚酶解制備抗氧化活性肽的工藝進行優(yōu)化，并對最優(yōu)條件下制得的酶解液進行分子量分布的測定和游離氨基酸含量的測定。以期為秋刀魚高值化利用和多肽類功能性食品的開發(fā)提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍秋刀魚 購于山東青島果蔬馨旗艦店，去頭、去尾、去內臟、去骨，清洗干凈后，絞成肉糜，備用；中性蛋白酶（20萬 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）

合肥博美生物科技有限責任公司；風味蛋白酶（3萬 U/g）、胰蛋白酶（25萬 U/g）、木瓜蛋白酶（80萬 U/g）、菠蘿蛋白酶（60萬 U/g）、維生素C（抗壞血酸）、1,10-菲羅啉 Solarbio（索萊寶）公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 福州飛凈生物科技有限公司；七水合硫酸亞鐵、焦性沒食子酸 國藥集團化學試劑有限公司；過氧化氫（30%） 天津市天力化學試劑有限公司；鐵氰化鉀 福晨（天津）化學試劑有限公司；三氯乙酸、FeCl3上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TH2-82A雙功能數顯恒溫振蕩器 上海梅香儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計、LC-20A型高效液相色譜儀 日本島津公司；SORVALL Stratos型冷凍高速離心機 美國Thermo公司；MSl05DU型分析天平、PL602-L型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FE-20FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；JB-1A磁力攪拌器 上海儀電科學儀器股份有限公司；FreeZone 2.5型真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 HITACHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 秋刀魚基本成分的測定 水分的測定：參考GB5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》。

灰分的測定：參考GB5009.4-2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》。

蛋白質的測定：參考GB5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》。

脂肪的測定：參考GB5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》。

1.2.2 蛋白酶的篩選 秋刀魚酶解液工藝制作流程：秋刀魚肉糜→加去離子水→調節(jié)至最適pH→酶解→滅酶→離心→抽濾→酶解液→冷凍干燥→凍干粉。選擇六種酶制劑對秋刀魚肉糜進行酶解，酶解條件見表1。酶解結束后，于100 ℃水浴加熱20 min滅酶，然后在4 ℃，8000 r/min條件下離心10 min，取上清液抽濾去除懸浮物及殘渣，得到酶解液。綜合考察水解度（DH）、TCA-可溶性肽含量以及抗氧化活性等指標，篩選出合適的蛋白酶。

表1 蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of proteases

1.2.3 單因素實驗 固定因素水平為料液比為1:3 g/mL，酶添加量為0.4%，酶解時間為4 h，溫度為50 ℃，pH7.0。通過測定酶解液的DH、DPPH自由基清除率和Fe3+還原力來研究料液比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL）、酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）、溫度（40、45、50、55、60 ℃）和pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對秋刀魚酶解工藝的影響。

1.2.4 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，以料液比、酶添加量、酶解時間三個因素進行響應面試驗設計，以DPPH自由基清除率和Fe3+還原力為指標，優(yōu)化秋刀魚制備抗氧化活性肽的最佳酶解工藝。響應面試驗因素水平表見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 DH的測定 秋刀魚酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的測定參考GB5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，總氮含量的測定參考GB5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，根據式（1）計算DH。

1.2.6 TCA-可溶性肽含量的測定 參考朱均旺等[15]的研究方法并稍作修改，吸取5 mL秋刀魚酶解液，加入等體積15% TCA，混合均勻，于室溫靜置30 min后離心（4 ℃，5000 r/min，15 min），吸取1 mL上清液，加入3 mL雙縮脲，室溫下靜置10 min后，在540 nm下測量樣品吸光值，按照回歸方程y=0.052x+0.023（R2=0.9924）計算TCA-可溶性肽含量。

1.2.7 DPPH自由基清除率的測定 參考XIE等[16]的研究方法并稍作修改，準確稱取7.92 mg DPPH，使用95%乙醇定容至100 mL；取2 mL秋刀魚酶解液（20 mg/mL），加入2 mL DPPH，在517 nm下測量吸光值A1；對照組1取2 mL秋刀魚酶解液，加入2 mL 95%乙醇，在517 nm下測量吸光值A2；對照組2取2 mL DPPH，加入2 mL蒸餾水，在517 nm下測量吸光值A3；調零組取2 mL蒸餾水，加入2 mL 95%乙醇；室溫下避光靜置30 min，按式（2）計算樣品的清除率。

1.2.8 Fe3+還原力的測定 參考LI等[17]的研究方法并稍作修改，將2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L pH6.6）、2 mL 1%鐵氰化鉀以及2 mL秋刀魚酶解液（20 mg/mL）混合均勻，置于50 ℃水浴中平衡20 min，加入2 mL 10% TCA，4 ℃、3000 r/min，離心10 min，取2 mL上清液，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵，10 min后在700 nm下測量吸光值。

1.2.9 ·OH清除率的測定 參考陳秋娟等[18]的研究方法并稍作修改，將1 mL 1,10-菲羅啉溶液（2.5 mmol/L）、1 mL PBS（20 mmol/L，pH7.4）與1 mL蒸餾水，混合均勻，加入1 mL FeSO4（2.5 mmol/L）與1 mL H2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴平衡90 min，在536 nm下測量吸光值，記為A1；空白組使用1 mL蒸餾水代替H2O2，記為A0；樣品組使用1 mL樣品溶液（20 mg/mL）代替蒸餾水，記為A2；按式（3）計算樣品的清除率。

1.2.10 O2?·清除率的測定 參考宋春艷等[19]的研究方法并稍作修改，取2 mL Tris-HCl（150 mmol/L，pH8.0）與0.6 mL樣品溶液（20 mg/mL）混合均勻，25 ℃預熱20 min，加入0.4 mL焦性沒食子酸（1.2 mmol/L），25 ℃水浴平衡20 min，在325 nm下測量吸光值，記為A11；對照組1使用等量蒸餾水代替焦性沒食子酸，記為A10；對照組2使用等量蒸餾水代替樣品，記為A01；空白組分別使用等量蒸餾水代替樣品和焦性沒食子酸，記為A00；按式4計算樣品的清除率。

1.2.11 秋刀魚酶解液分子量分布的測定 參考GB31645-2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》。準確稱取1.00 g酶解液凍干粉，用1 mL流動相溶解，高速離心，取上清液進樣檢測。檢測條件為色譜柱型號：Shodex Asahi pak GS-320 HQ No.R2870036，流動相：乙腈:水:三氟乙酸（40:60:0.05），流速：0.5 mL/min，柱溫箱：30 ℃，檢測波長：220 nm，各標準品分子量：MW12500、MW6500、MW1450、MW451、MW189。

1.2.12 秋刀魚酶解液游離氨基酸含量的測定 參考陳劍嵐[20]的研究方法并稍作修改。準確稱取2.00 g秋刀魚酶解液凍干粉，加入15 mL 15%的TCA，混合均勻，靜置2 h，在4 ℃、10000 r/min條件下離心15 min，取上清液5 mL，用3 mol/L NaOH將pH調為2.0，定容至10 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾后上機檢測。

氨基酸自動分析儀條件：色譜柱（4.6 mm I.D.×60 mm）；分離樹脂：陽離子交換樹脂；柱溫：57 ℃；檢測波長：570 nm；管路一緩沖液流速：0.4 mL/min；管路二緩沖液流速：0.35 mL/min；反應液：茚三酮；進樣量：20 μL。

1.3 數據處理

每組數據平行測定3次，采用Excel 2016和IBM SPSS Statistics 22.0進行處理，結果采用均值±標準差形式，均值比較采用ANOVA中的Duncan法進行比較，取95%置信度（P<0.05）。采用Origin 2018軟件進行數據繪圖。Box-Behnken試驗設計和響應面方差分析采用軟件Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 秋刀魚的基本組成成分

由表3可知，秋刀魚肌肉中水分含量約為60.32%，灰分含量約為1.02%，蛋白質含量約為18.12%，脂肪含量約為20.48%。由此可見，秋刀魚是一種高蛋白質、高脂肪含量的魚類。這與葉旭昌等[21]的研究結果相似但稍有差異，可能是由于秋刀魚的生長環(huán)境和年齡的差異所致。

表3 秋刀魚的基本組成成分Table 3 The basic components of Pacific saury

2.2 蛋白酶的篩選

酶解可以將蛋白質水解成小分子物質，DH是衡量酶解效果的重要指標之一[22]。由圖1（A）可知，中性蛋白酶處理組DH達22.4%，顯著高于其它處理組（P<0.05），而胰蛋白酶處理組DH最低，為15.8%。這是因為中性蛋白酶酶切位點較為廣泛，能夠酶解R1為Ala、Leu、Val、Tyr、Phe和Trp殘基的肽鍵[23]，而胰蛋白酶是一種Ser內切酶，只能酶解R1為Arg或Lys殘基的肽鍵[24]。

三氯乙酸（TCA）能夠溶解小分子蛋白質或肽段，大分子蛋白質或肽段會在TCA的作用下變成白色沉淀，TCA-可溶性肽含量是表征酶解效果的重要指標[25]。由圖1（A）可知，中性蛋白酶處理組TCA-可溶性肽含量達14.22 mg/mL，顯著高于其它處理組（P<0.05），風味蛋白酶處理組TCA-可溶性肽含量最低，為13.3 mg/mL。這是因為蛋白質經蛋白酶水解后，以小分子肽或者游離氨基酸的形式存在，因此，DH較高的組分，蛋白質水解較為充分，其TCA-可溶性肽含量也較高[26]。

DPPH自由基清除率是一種常用的測定化合物和食品抗氧化能力的方法。由圖1（B）可知，中性蛋白酶處理組DPPH自由基清除率顯著高于其它處理組（P<0.05），約為89.2%，堿性蛋白酶處理組DPPH自由基清除率最低，約為74.7%。這與夏吉安等[27]的研究結果相似。

還原力與抗氧化活性之間存在一定的聯系，抗氧化劑通過還原作用清除自由基，因此，還原力越強，抗氧化活性越強[28]。由圖1（B）可知，中性蛋白酶處理組的Fe3+還原力顯著高于其它處理組（P<0.05），為0.68。胰蛋白酶處理組的Fe3+還原力最低，為0.52。這與寧詩文等[29]的研究結果相似。

過量的·OH會對人體產生巨大的危害，它通過電子的轉移、奪取氫原子等方式對蛋白質及脂質進行氧化，因此，·OH清除率是評價樣品抗氧化強弱的重要指標之一[30]。由圖1（C）可知，中性蛋白酶處理組的·OH清除率顯著高于其它處理組（P<0.05），為66.5%。胰蛋白酶處理組·OH清除率最低，為41.7%。這與王志等[31]的研究結果相似。

圖1 不同種類蛋白酶處理組酶解液的水解度、TCA-可溶性肽含量和抗氧化能力Fig.1 The degree of hydrolysis, the content of TCA-soluble peptide and the antioxidant capacity of the hydrolysate treated by different kinds of protease

O2?·可導致細胞膜受損，從而引起一系列的有害反應。但在人體中，O2?·在超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的催化作用下會生成氧氣和水，從而降低其對生物體的損害[32]。由圖1（C）可知，中性蛋白酶處理組O2?·清除率為81.7%，顯著高于其它處理組（P<0.05）。這與黃典等[33]的研究結果相似。

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 料液比對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 料液比對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結果如圖2所示。由圖2可知，隨著料液比的增大，秋刀魚酶解液DH、DPPH自由基清除率和Fe3+還原力呈先升高后下降的趨勢，這是因為隨著料液比的增大，底物與酶能夠充分接觸，從而提高酶解效率。但當反應體系中溶劑含量過高時，底物會被稀釋，增大了酶與底物的接觸難度，導致體系酶解不完全。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取料液比為1:3進行后續(xù)實驗。

圖2 料液比對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.3.2 酶添加量對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 酶添加量對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結果如圖3所示。由圖3可知，隨著酶添加量的增加，秋刀魚酶解液DH呈逐漸上升趨勢。酶解液抗氧化能力隨著酶添加量的增加先升高后下降。這是因為隨著酶添加量的增加，酶與底物接觸更加充分，但酶添加量過多時，會使底物發(fā)生過度水解，導致酶解液中抗氧化活性肽的降解。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取酶添加量為0.6%進行后續(xù)實驗。

圖3 酶添加量對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of quantity of enzyme on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.3.3 酶解時間對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 酶解時間對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結果如圖4所示。由圖4可知，隨著酶解時間的增加，秋刀魚酶解液DH逐漸升高，DPPH自由基清除率和Fe3+還原力呈現出先升高后降低的趨勢。這是因為，隨著酶解時間的增加，酶解程度逐漸加深，但酶解時間過長，會導致底物過度水解，造成抗氧化活性肽的過度降解和低活性氨基酸的生成[34]。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取酶解時間為

圖4 酶解時間對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

4 h進行后續(xù)實驗。

2.3.4 溫度對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 溫度對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結果如圖5所示。由圖5可知，隨著溫度的升高，秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力呈現先升高后降低的趨勢。這是因為在一定范圍內，隨著溫度的升高，酶活力開始提高，有利于酶解反應的進行，但溫度過高會降低蛋白酶活力。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取溫度為50 ℃進行后續(xù)實驗。

圖5 溫度對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of temperature on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.3.5 pH對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響

pH對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結果如圖6所示。由圖6可知，隨著pH的增加，秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力呈現先升高后下降的趨勢，這是因為pH過高或過低都會破壞蛋白酶活性中心或空間結構[35]。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取pH7.0進行后續(xù)實驗。

圖6 pH對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of pH on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.4 響應面試驗結果

選取料液比（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）3個因素，以DPPH自由基清除率（R1）和Fe3+還原力（R2）為響應值，進行響應面優(yōu)化試驗，分析酶解秋刀魚制備抗氧化活性肽的最佳工藝條件。試驗設計結果見表4。

表4 響應面分析方案及試驗結果Table 4 Program and experimental results of response surface methodology

運用 Design-Expert.V8.0.6軟件，對響應值進行回歸擬合，得到DPPH自由基清除率（R1）和Fe3+還原力（R2）的回歸方程：

由表5可知，模型F值分別為18.35和29.43，“Prob>F”值均小于0.05，表明該二次方程模型顯著。失擬項P>0.05，不顯著。決定系數R2分別為0.9593和0.9743，說明預測值與實測值之間具有較高的相關性。RAdj2=0.9071和0.9411，說明所選用的二次回歸模型是適當的。因此可用該回歸方程對試驗結果進行預測分析。從表5可以看出，各個因素對DPPH自由基清除率和Fe3+還原力的影響不是簡單的線性關系。由F值可知，三個因素對實驗結果影響大小依次為料液比>酶添加量>酶解時間。響應面可以直觀地反映出各因素之間的交互作用對響應值的影響，曲面的坡度則表示兩因素之間交互影響的大小[36]。為了更加直觀的表現2個因素同時對DPPH自由基清除率和Fe3+還原力的影響，繪制響應面圖（如圖7）。由圖7可以看出，料液比和酶添加量、料液比和酶解時間、酶添加量和酶解時間的交互作用不顯著。經Design Expert 8.0.6軟件分析該模型得到的最佳酶解條件為料液比1:2.67、酶添加量0.60%、酶解時間4.04 h、溫度50 ℃、pH7.0。在此條件下，計算出酶解液DPPH自由基清除率為92.57%、Fe3+還原力為0.716。

圖7 各因素之間交互作用的曲面圖Fig.7 Surface diagrams for interaction of two different factors

表5 DPPH自由基清除率和Fe3+還原力的響應面二次模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the response surface quadratic model for DPPH free radical scavenging rates and Fe3+reducing powers

使用由Design Expert 8.0.6軟件計算得到的最優(yōu)酶解條件對秋刀魚進行酶解，從而驗證響應面法的可行性。工藝參數為：料液比1:2.67、酶添加量0.6%、酶解時間4.04 h、溫度50 ℃、pH7.0。在該條件下得到的酶解液的DPPH自由基清除率為（92.33%±0.68%），Fe3+還原力為0.711±0.012，與預測值無顯著性差異（P>0.05）。

2.5 秋刀魚酶解液分子量的分布情況

圖8為最佳酶解工藝條件下制得的秋刀魚酶解液分子量的分布情況。由圖8可知，酶解液的分子量在<3000 Da范圍內的組分占97.87%，這一組分的肽段對酶解液的營養(yǎng)價值和生物活性起著重要的作用[37]。

圖8 秋刀魚酶解液分子量分布Fig.8 Molecular weight distributions profile of Pacific saury hydrolysate

2.6 秋刀魚酶解液中游離氨基酸的含量

表6為秋刀魚酶解液中游離氨基酸的含量。由表6可知，酶解液中共檢測到16種游離氨基酸，其中，必需氨基酸含量占39.79%，支鏈氨基酸占17.21%，抗氧化活性氨基酸占37.01%。組氨酸含量最高，為322.63 mg/100 mL。組氨酸對于嬰兒來說屬于必需氨基酸，對嬰兒的生長發(fā)育至關重要。此外，組氨酸能夠促進氨基酸與血紅蛋白的結合，使腎原性貧血減輕，所以組氨酸也是尿毒癥患者的必需氨基酸。可見，秋刀魚酶解液具有較高的營養(yǎng)保健功能。

表6 秋刀魚酶解液中游離氨基酸含量Table 6 Free amino acid contents of Pacific saury hydrolysate

3 結論

綜合DH、TCA-可溶性肽含量和抗氧化活性等指標，從六種商用蛋白酶中篩選出中性蛋白酶作為秋刀魚酶解用酶。經單因素實驗以及響應面分析方法對酶解秋刀魚制備抗氧化活性肽的工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數：料液比為1:2.67、酶添加量為0.60%、酶解時間為4.04 h、溫度為50 ℃、pH7.0。在此條件下，酶解液的DPPH自由基清除率為92.33%，Fe3+還原力為0.711（20 mg/mL）各因素對酶解液的抗氧化活性影響大小為料液比>酶添加量>酶解時間。通過測定分子量分布和游離氨基酸含量，發(fā)現最優(yōu)條件下酶解液分子量<3000 Da的組分占97.87%，是酶解液的主要成分。共檢測出16種游離氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸含量的39.79%，抗氧化活性氨基酸占總氨基酸含量的37.01%。本研究為秋刀魚的高值化利用和多肽類功能性食品的研發(fā)提供了參考依據。下一步將會對秋刀魚酶解液進行分離純化，并對抗氧化活性較強的組分進行質譜鑒定，以期得到全新的抗氧化活性肽段，豐富抗氧化活性肽的種類。