基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析五味子治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制

任媛媛，王 超，謝 勇，郭光鵬，黃勤挽, ，王 瑾,

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川成都 611137；2.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川成都 610042；3.吉林省北域紅藥業(yè)有限公司，吉林通化 134000；4.四川利民中藥飲片有限責(zé)任公司，四川成都 611331）

非酒精脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的慢性肝病，世界范圍內(nèi)非酒精脂肪肝的發(fā)病率和流行率正在迅速上升。非酒精脂肪肝全球患病率約為25%，影響著全球四分之一的成年人[1?2]。非酒精脂肪肝包括一系列疾病，包括單純性脂肪肝（NAFL）或單純性脂肪變性（其病程為良性）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌（HCC）和肝硬化[3?6]。非酒精脂肪肝既可以導(dǎo)致肝病殘疾和死亡，還與代謝綜合征、肥胖、Ⅱ型糖尿病（Type 2 diabetes, T2DM）、心血管疾病及結(jié)直腸腫瘤等的高發(fā)密切相關(guān)[7?8]。藥食同源具有綜合保健治療作用，副作用小，可以調(diào)節(jié)人體生理活動、預(yù)防疾病、長期服用，在醫(yī)療保健和食品行業(yè)廣泛應(yīng)用[9]。因此，探索來源于食品或藥食同源具有預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝病作用的原輔料十分重要。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，五味子具有抗炎、抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力及保護(hù)肝臟等作用[10?14]，主要包含木脂素類、三萜類、黃酮類等物質(zhì)[15?16]。五味子是一種藥食兼用型原料，營養(yǎng)豐富，對人體有較好的保健作用，可用于多種產(chǎn)品的開發(fā)，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。如將五味子保護(hù)肝腎的功效與果醋具有的降脂減肥、促進(jìn)新陳代謝、抗菌、抗疲勞等功能結(jié)合生產(chǎn)出的具有保健作用的五味子果醋[17]，具有提高免疫力、改善睡眠等功能的五味子酒[14]，有較強(qiáng)的抗氧化活性石榴五味子復(fù)合保健酒[18]，此外還有五味子飲料產(chǎn)品、五味子酸奶產(chǎn)品及五味子果醬產(chǎn)品等[19?21]。研究表明，五味子保肝護(hù)肝作用明顯[22]，由此，五味子治療非酒精脂肪肝的相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和研究具有重要意義。但是，目前對五味子治療非酒精脂肪肝的研究較少，尤其在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究方面。因此，研究五味子活性成分治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制具十分必要。本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出五味子治療非酒精性脂肪肝的核心成分與關(guān)鍵靶點，并應(yīng)用分子對接驗證分析，系統(tǒng)的分析了五味子治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，以期為尋找治療非酒精性脂肪肝的植物來源的天然化合物的保健食品開發(fā)提供高效篩選的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子甲素（批號：MUST-19092908，純度為99.35%）、五味子乙素（批號：MUST-19041810，純度為99.11%）、五味子酯甲（批號：MUST-19062302，純度為99.38）、五味子醇甲（批號：MUST-19031905，純度為99.46%） 成都曼思特生物科技有限公司；五味子酯乙（批號：DST201218-011，純度≥98%）、五味子醇乙（批號：DST201129-013，純度≥98%）、五味子酚（批號：DST200825-015，純度≥98%） 成都德思特生物科技有限公司；乙腈、甲酸 色譜級，Thermo Fisher Scientific；采用屈臣氏蒸餾水制備樣品和流動相，其他所有試劑均為分析純；五味子飲片 吉林省北域紅藥業(yè)有限公司，批號20201206，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)黃勤挽教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果實。

Vanquish型超高效液相色譜-Q-Exactive型四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；UPH-I-10T型超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司；FA1204C型1/1萬電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；AUW220D型1/10萬電子分析天平 日本島津公司；KS-500DE型液晶超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酚、五味子酯甲、五味子酯乙對照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為702、376、970、652、516、402、632 mg/L的單一對照品儲備液。分別取上述儲備液適量，加甲醇混勻，即得混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取五味子樣品（粉碎，過三號篩）0.5 g，置25 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲波水浴30 min（頻率40 kHz，功率100 W），冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足體積，混勻，過濾，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3 UPLC-Q-Orbitrap HRMS數(shù)據(jù)采集

1.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫：0~15 min，5%~30% B；15~30 min，30%~65% B；30~45 min，65%~95% B，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式檢測，全掃描的主分辨率為70000，掃描范圍為m/z=100~1500。噴涂電壓的正模式和負(fù)模式分別設(shè)定為3500 V與3000 V，正模式和負(fù)模式的探針加熱器溫度都設(shè)置為350 ℃，正模式和負(fù)模式的毛細(xì)管溫度均設(shè)置在300 ℃，正模式和負(fù)模式的鞘氣均設(shè)定在35 arb，正模式和負(fù)模式的輔助氣體都設(shè)定在10 arb。S-Lens射頻電平設(shè)置為50。全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd MS2），一級分辨率35000，二次分辨率為17500，碰撞能量梯度設(shè)定為20、40和60 eV。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 利用Compound Discoverer3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行需求和處理[23]。軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊和峰提取，得到分子離子峰，及同位素擬合的可能分子式。并將測得的二級光譜片段分別與mzCloud數(shù)據(jù)庫和mzVault本地中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配。保留化學(xué)成分符合峰面積閾值大于80000，質(zhì)量偏差小于5 ppm，匹配得分大于80。最后，參考對照品和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步確證該化合物[24]。

1.4 構(gòu)建和分析五味子“藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點途徑”交互網(wǎng)絡(luò)

1.4.1 潛在靶點的收集 成分相關(guān)靶點：以UPLCQ-Orbitrap HRMS鑒定出的化學(xué)成分為研究對象，導(dǎo)入PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得Canonical SMILES。在TCMSP （ http://tcmspw.com/tcmsp.php）與SwissTarget Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）在線平臺中查找各個成分對應(yīng)的靶點蛋白，得到成分相關(guān)靶點[25]。

疾病相關(guān)靶點：在包括GeneCards (https://www.genecards.org/)，CTD (http://ctdbase.org/)，OMIM(https://www.omim.org/)，Dis-GeNET (https://www.disgenet.org/)，GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

在內(nèi)的五個數(shù)據(jù)庫中，以“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集相關(guān)的目標(biāo)，得到疾病相關(guān)靶點[26]。

利用交互式韋恩圖制作平臺（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）進(jìn)行韋恩分析，繪制成分靶點和疾病靶點的Venn圖。重疊的共同靶點可能是五味子治療非酒精脂肪肝的關(guān)鍵靶點。

所有靶點，無論是成分靶點還是疾病靶點，都刪除了重復(fù)值和無效值，然后全部進(jìn)入Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）校準(zhǔn)靶蛋白和基因信息，它們都是被核對的人類基因名稱。

1.4.2 活性成分和潛在靶點的篩選 將成分和非酒精性脂肪肝相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化分析。使用“Network Analyzer”插件計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩裕炊戎担╠egree）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)排序，并將高于中值（median）的成分作為核心成分。利用String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）分析成分和非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)[27]，并將物種定義為“Homo sapiens”，選擇0.9的高置信度以保證數(shù)據(jù)的可靠性，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，然后導(dǎo)出結(jié)果。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件對所建PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，使用“Network Analyzer”插件計算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩裕「哂谥兄档陌悬c為核心靶點[28]。

1.4.3 富集分析和通路分析 利用R 4.3.0對選擇的核心靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析。選取P<0.05的相關(guān)結(jié)果，對前20個結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4.4 “藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點途徑”網(wǎng)絡(luò)模構(gòu)建

基于核心成分與蛋白靶點的關(guān)系及蛋白靶點與信號通路之間的相互關(guān)系，利用Cystocape軟件進(jìn)行可視化，得到五味子治療非酒精脂肪肝的“藥物-核心活性成分-靶點-部分通路”網(wǎng)絡(luò)模型圖。

1.5 分子對接

為了驗證篩選出的化合物和靶標(biāo)的有效性，對前5個活性化合物和前4個核心靶點進(jìn)行了分子對接。臨床上療效肯定的降脂藥非諾貝特作為陽性對照。通過PubChem ( https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)，利用Chem3D 19.0軟件將其轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行能量最小化操作，以mol2格式保存。4個核心靶點對應(yīng)的蛋白均取自RCSB PDB（https://www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中，來源設(shè)置為人類，晶體選擇信息（Resolution、PDB ID）詳見表 3，以此獲得靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)，以pdb格式保存。利用PyMOL 4.6.0軟件對蛋白進(jìn)行去除水分子、去殘基等操作，使用spdbv 4.1.0軟件使蛋白能量最小化。然后使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對蛋白（受體）和成分（配體）進(jìn)行加氫和加電荷處理，并轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。接著在AutoDock Tools中設(shè)置對接的網(wǎng)格點和尺寸，使對接盒子（grid box）包裹整個蛋白。再利用AutoDock Tools中AutoDock Vina進(jìn)行半柔性分子對接，分別預(yù)測了化合物的9種不同的模式（modes）并以pdbqt格式保存。具有最高結(jié)合親和力并與受體具有相應(yīng)相互作用的模式被保存并在PyMOL中可視化[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-Q-Orbitrap HRMS鑒定五味子的化學(xué)成分

利用Compound Discoverer 3.0軟件計算出在5 ppm質(zhì)量偏差范圍內(nèi)的分子式，然后結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫mzCloud和mzVault數(shù)據(jù)庫，以及參考文獻(xiàn)[30?37]，對化合物的相對分子質(zhì)量、保留時間（tR）和碎片離子信息進(jìn)行識別，結(jié)果初步鑒定出了50個化學(xué)成分，其中包含11個木脂素類成分，9個黃酮類成分，9個氨基酸類成分，7個有機(jī)酸類成分，3個核苷類成分，7個酚酸類成分，和4個其它成分。其中，經(jīng)對照品鑒定了7個木脂素類成分，分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酚、五味子酯甲及五味子酯乙，且在樣品中相應(yīng)峰的響應(yīng)值較高。結(jié)果表明，樣品中的所含的木脂素類成分的種類最多。總離子流圖（Total ion chromatogram，TIC）見圖1，鑒定的化合物的最終結(jié)果如表1所示。

表1 五味子化學(xué)成分的UPLC-Q-Orbitrap HRMS鑒定Table 1 Identified compounds of SC by UHPLC-Q-Orbitrap HRMS

2.2 五味子關(guān)鍵活性化合物及治療非酒精性脂肪肝潛在靶點的預(yù)測

通過聯(lián)合使用多個數(shù)據(jù)庫，在刪除重復(fù)和無效目標(biāo)后，共獲得747個成分靶點和2178個非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點。Venn圖發(fā)現(xiàn)有246個相交靶點（圖2），說明五味子具有治療非酒精性脂肪肝的作用。在成分-非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)中（圖3），有295個節(jié)點和880個邊與五味子的49個化合物相關(guān)，246個靶點與非酒精性脂肪肝相關(guān)。度值（Degree）越大說明相連節(jié)點越多，在整個網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用也就越大。通過網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治觯瑢⒏哂谥兄档幕衔镆暈楹诵幕钚猿煞郑茶b定出23個化合物，按度值由大到小分別為：槲皮素、山柰酚、五味子甲素、α-亞麻酸、五味子醇乙、五味子酯乙、戈米辛J、當(dāng)歸酰戈米辛H、戈米辛G、五味子酯甲、五味子醇甲、小檗堿、原花青素B1、原花青素B2、奎尼酸、腺苷、蘆丁、苯丙氨酸、天冬氨酸、富馬酸、對香豆酸、表兒茶素和原兒茶酸。其中，槲皮素的度值最大，且中間中心性（Betweenness centrality）和接近中心性（Closeness centrality）也最大，平均最短路徑長度（Average shortest path length）也很小，說明這個化合物在整個網(wǎng)絡(luò)中非常重要。

圖2 五味子治療非酒精性脂肪肝潛在靶點的韋恩分析Fig.2 Venn’s analysis of potential targets for the treatment of the NAFLD with SC

圖3 化合物和非酒精性脂肪肝相交靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The network of compounds and NAFLD intersection targets

續(xù)表 1

將246個相交靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。選擇物種為智人（Homo sapiens），設(shè)置目標(biāo)之間所需的最低連接分?jǐn)?shù)為0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點,構(gòu)建一個PPI網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析，顯示217個靶點，同時進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯罱K的分析結(jié)果顯示，22個靶點的度值高于中值14（圖4）。此外，根據(jù)度值由大到小，發(fā)現(xiàn)前12個靶點之間存在相對復(fù)雜的關(guān)系。除了SRC、PI3KR1、EGFR、VEGFA、TP53和ESR1外，其他目標(biāo)AKT1、HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1、MAPK3和JUN的中介中心度（Betweenness centrality）和接近中心度（Closeness centrality）都排名靠前，表明這些靶點發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。將成分-非酒精性脂肪肝靶點網(wǎng)絡(luò)分析度值前10的靶點與PPI靶點網(wǎng)絡(luò)分析篩選的前10個靶點相交，得到2個靶標(biāo)，即為SRC和EGFR，這意味著這2個靶點可能起著非常關(guān)鍵的作用。

圖4 五味子治療非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein-protein interaction network of potential targets for SC treatment of NAFLD

2.3 關(guān)鍵靶點GO和KEGG富集分析

將化合物和非酒精性脂肪肝相交靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)中度值前10的靶點和PPI網(wǎng)絡(luò)中度值高于中值的22個靶點，共30個靶點（表2）作為核心靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析分析。通過GO富集分析，共獲得935個生物過程（Biological process，BP）條目，主要涉及蛋白激酶B信號的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路和T細(xì)胞共刺激等方面；50個細(xì)胞組成（Cell composition，CC）條目，膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔和膜區(qū)的占比較大；54個分子功能項（Molecular function，MF），其中磷酸酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性及磷蛋白結(jié)合等較為顯著。KEGG通路富集分析共鑒定出119個結(jié)果，主要涉及癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）和雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）等。研究組將前20個結(jié)果可視化，見圖5。氣泡越大，富含的基因越多。P調(diào)整值越小，氣泡的顏色越紅。

圖5 五味子治療非酒精性脂肪肝核心靶點的GO富集和KEGG通路分析Fig.5 GO enrichment and KEGG pathway analysis of SC treatment of NAFLD core targets

表2 五味子治療非酒精性脂肪肝的核心靶點Table 2 Key target of SC for the treatment of NAFLD

為了更好地展示藥材、活性成分、靶點和途徑之間的關(guān)系，根據(jù)藥物、成分、潛在靶點及信號通路之間的相互關(guān)系，選取鑒定出的23個核心活性成分與五味子治療非酒精性脂肪肝潛在靶點進(jìn)行匹配，將核心靶點的前4名AKT1、HSP90AA1、SRC和MAPK1與關(guān)鍵信號通路的前20條進(jìn)行匹配，共匹配得到14條信號通路。使用Cytoscape構(gòu)建“藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點-部分途徑”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖6 五味子治療非酒精性脂肪肝的“藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點-部分途徑”網(wǎng)絡(luò)模型Fig.6 Herb-core active component-target-partial pathway network of SC for the treatment of NAFLD

2.4 分子對接

為了表征非酒精性脂肪肝相關(guān)蛋白與五味子活性成分的分子相互作用和結(jié)合親和力，本文使用AutoDock Tools中的AutoDock Vina將篩選出的前5個活性成分及非諾貝特分別與PPI網(wǎng)絡(luò)中前4的靶點進(jìn)行分子對接（圖7，表3）。一般認(rèn)為若結(jié)合能<0，表明配體分子能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，若結(jié)合能≤?5.0 kcal/mol，表明其結(jié)合性好。結(jié)合能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。化合物槲皮素和蛋白SRC的MET344、GLU342、ASP407、LYS298和GLU313形成氫鍵，結(jié)合能為-10.1 kcal/mol，如圖7A所示。山柰酚和蛋白SRC的GLU342和MET344形成氫鍵，結(jié)合能為-10.0 kcal/mol，如圖7B所示。五味子甲素與蛋白HSP90AA1的LYS58 形成氫鍵，結(jié)合能為-7.2 kcal/mol，如圖7C所示。α-亞麻酸和蛋白HSP90AA1的SGLY135、PHE138和ASN51形成氫鍵，結(jié)合能為-7.4 kcal/mol，如圖7D所示。五味子醇乙和蛋白MAPK1的LYS151、THR190、TYR36形成氫鍵，結(jié)合能為-6.5 kcal/mol，如圖7E所示。非諾貝特和蛋白HSP90AA1的TRP162和ASN51形成氫鍵，結(jié)合能為-8.7 kcal/mol，如圖7F所示。此外，上述活性化合物與相關(guān)蛋白結(jié)合至少形成了一個氫鍵相互作用力。結(jié)果表明，上述5個活性成分及非諾貝特與目標(biāo)蛋白之間均有穩(wěn)定的結(jié)合（結(jié)合能<-5.0 kcal/mol）。

表3 分子對接結(jié)果Table 3 Molecular docking results

圖7 部分分子對接結(jié)果Fig.7 Partial results of molecular docking

3 討論與結(jié)論

非酒精脂肪肝與肝臟脂肪細(xì)胞過度堆積及炎癥等有著緊密的關(guān)聯(lián)[38]，是全球最嚴(yán)重的代謝疾病之一[39]，對眾多患者的生活質(zhì)量與生命安全產(chǎn)生影響。目前對于非酒精脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尚未清晰，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)可“二次打擊學(xué)說”，即以胰島素抵抗（Insulin resistance, IR）為主要環(huán)節(jié)的“第一次打擊”和以肝細(xì)胞大量凋亡、氧化應(yīng)激和纖維化為主的“二次打擊”[40]。現(xiàn)代藥理研究表明，五味子可以保護(hù)肝臟，明顯改善肝纖維化等[41]。因此，研究五味子治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為尋找治療非酒精性脂肪肝的植物來源的天然化合物的保健食品和治療藥物開發(fā)提供高效篩選的方法具有重要意義。

為此，本研究利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)從五味子中共鑒定了50個成分，通過網(wǎng)絡(luò)藥理分析，最終得到23種主要活性成分。通過文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)其中的一些成分可以通過脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)途徑等對非酒精脂肪肝發(fā)揮保護(hù)或治療作用[42?44]。例如，在高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的非酒精脂肪肝的小鼠模型中，五味子甲素可以通過降低肝臟中脂肪酸和甘油三酯合成酶的活性來降低高脂飲食小鼠血漿和肝臟中FFA和甘油三酯的含量。同時增加肝臟脂肪酸氧化和糞便游離脂肪酸和甘油三酯排泄。并且，這些對肝臟的有益作用也與五味子甲素改善氧化應(yīng)激有關(guān)[45]。在非酒精脂肪肝細(xì)胞模型中，五味子乙素可以劑量依賴性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活，進(jìn)而影響脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)，從而降低脂質(zhì)堆積[40]。在T2DM誘導(dǎo)非酒精脂肪肝小鼠模型中，槲皮素治療可以明顯緩解Lepdb/Lepdb小鼠的肝腫脹，恢復(fù)異常的肝酶，降低肝臟中的高血糖和脂質(zhì)積累。進(jìn)一步研究表明，槲皮素治療可通過抗氧化、抗炎和激活FXR1/TGR5信號通路改善TD2M誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝[46]。

同時，本文通過分析藥物相關(guān)靶點和非酒精脂肪肝相關(guān)靶點，確定了246個交叉靶點。去除29個自由靶標(biāo)后，以217個相交靶標(biāo)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，從中識別出22個核心靶標(biāo)，將它們與成分-非酒精性脂肪肝靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析篩選的前10個靶點相交共得到30個靶點，其中重復(fù)的SRC和EGFR可能起著非常關(guān)鍵的作用，它們或多或少被認(rèn)為會影響非酒精脂肪肝。例如，研究表明，SRC通路的激活，增加了IP3R1蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)了IP3R1的Tyr353磷酸化，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體Ca2+超載和線粒體功能障礙。因此，抑制SRC/IP3R1通路，可能是一種新的潛在的治療非酒精脂肪肝的方法[47]。表皮生長因子受體（EGFR）是肝細(xì)胞增殖和肝再生的重要調(diào)節(jié)因子。EGFR還可以調(diào)節(jié)肝部分切除術(shù)后肝再生過程中的脂質(zhì)代謝，抑制EGFR也可以改善已經(jīng)發(fā)展的纖維化[48?49]。同時，研究表明，在非酒精脂肪肝小鼠模型中，抑制EGFR可顯著降低脂肪變性、肝損傷、肝纖維化，改善糖耐量。表明了EGFR在非酒精脂肪肝中的作用，以及EGFR抑制作為非酒精脂肪肝治療策略的潛力[50]。此外，MAPK1是炎癥評價的指標(biāo)之一。VEGFA是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、增殖和血管形成等作用，參與了非酒精脂肪肝的病理生理過程[51]。

為了進(jìn)一步探索五味子的作用機(jī)制，本文對選擇的30個潛在核心靶點進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果表明，五味子的有效成分主要影響了蛋白激酶B信號的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路和T細(xì)胞共刺激等方面。KEGG通路富集分析表明，五味子主要參與癌癥中的蛋白聚糖、內(nèi)分泌抵抗、Rap1信號通路、VEGF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號通路和雌激素信號通路等。既往研究表明，非酒精脂肪肝的發(fā)展與內(nèi)分泌，血管新生和糖尿病并發(fā)癥中的信號通路密切相關(guān)[51?54]。

本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)共鑒定出五味子中的50種成分，其中包含11個木脂素類成分，9個黃酮類成分，9個氨基酸類成分，7個有機(jī)酸類成分，3個核苷類成分，7個酚酸類成分，和4個其它成分。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，確定了23個潛在的關(guān)鍵活性成分和30個潛在靶點，這23個核心活性成分可能主要通過作用于脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)途徑等來改善非酒精脂肪肝的癥狀。進(jìn)一步分析表明，五味子可能通過影響內(nèi)分泌、血管新生和糖尿病并發(fā)癥中的信號通路影響非酒精脂肪肝，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，五味子可能通過多成分多靶點的方式影響非酒精性脂肪肝的病理生理過程。該研究為進(jìn)一步研究五味子治療非酒精性脂肪肝提供了理論依據(jù)和實驗參考。