三種miRNA對肝癌預后預測的生物信息學分析模型

林思其，張澤鑫，夏睿琪，劉紫鳳，陳林靜，陳栩靜，陳祎琦

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上第5 大常見的惡性腫瘤[1]，全球發病率逐步上升[2]。目前，手術治療是HCC 的主要治療方法，然而術后5 年復發率已達70%[3]，生存質量難以提高。到目前為止，一些生物標志物已被證明與HCC 的發生發展相關，但其可靠性仍存在爭議。miRNA 是一種非編碼RNA，其失調會導致細胞的異常生長和生物合成，促進腫瘤的發生發展[4]。此外，不同表達譜的miRNA 可以作為腫瘤診斷和預后的分子標志物，如血清miR-122 可以作為HCC 診斷標志物之一[5]。Liu G 等[6]已構建了HCC 的miRNA 特征預后模型，但并沒有進行驗證和風險評估。本研究構建并驗證了一種新的miRNA 預后模型，旨在評估TCGA 數據庫中HCC 患者過度生存情況，探究三種miRNA 信號的潛在生物學特征、腫瘤相關功能和信號通路，為了解HCC 模型的分子機制提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據下載和處理 miRNA 的表達數據如下：[病例（373）：項目（TCGA）、項目（TCGA-LIHC）、基本位點（肝臟）、疾病類型（腺瘤和腺癌）；檔案（425）：數據：類型（亞型表達定量分析）、類別（轉錄組分析）]。mRNA 表達數據如下：[病例（371）：項目（TCGA）、項目（TCGA-LIHC）、基本位點（肝臟）、疾病類型（腺瘤和腺癌）；檔案（424）：數據：類型（基因表達定量分析）、類別（轉錄組分析）]；相關臨床信息（377）（數據格式：bcr xml，數據類別：臨床）。從癌癥基因組圖譜（TCGA）的官方網站下載所有數據。miRNA 表達數據包含375 個癌細胞樣本和50 個普通細胞樣本，而mRNA 表達數據包括374 個癌細胞樣本和50 個普通細胞樣本。

1.2 數據分析 所有數據分析均使用R 語言的3.6.1版本和相關軟件包。

1.2.1 差異表達miRNA、mRNA 的檢測及與臨床生存時間的聯合分析 根據校正后的P值標準（>1 和（FDR）＜0.05），檢測出差異表達的miRNA 和mRNA 的數據，使用R 語言的邊緣包進行標準化。將所有患者生存時間數據與標準化的miRNA 和mRNA 差異表達數據相結合。1.2.2 樣本分組、模型構建、評估和驗證 使用R 語言v.3.6.1 的“caret”包，將包含總生存時間和差異表達的miRNA 數據樣本，以非特異性方式分為測試組和訓練組。通過單因素Cox 回歸分析對訓練組進行檢驗，P＜0.05。檢驗的結果通過R 語言中的“Coxph”函數和“direction=both”函數進行多因素Cox 回歸分析。根據風險評分進行分組后，該模型通過Log-rank檢驗和Kaplan-Meier 曲線對患者生存預后進行評估，得到中位數。使用“survivalROC”軟件包評估miRNA 模型的預測能力，獲得3 年依賴的ROC 曲線，并計算曲線下面積（AUC）。

1.2.3 獨立預后潛力評估 使用單因素Cox 回歸分析確定miRNA 表達數據與HCC 患者總生存時間，以及其他臨床信息（年齡、性別、分級、臨床分期、腫瘤浸潤、淋巴結和遠處轉移）之間的相關性。滿足P＜0.05 的變量進一步使用多因素Cox 回歸進行分析，證明其為具有獨立作為預后因素的潛力。

1.2.4 三種miRNA 的靶基因及潛在活性預測 從miRDB、TargetScan 和miRTarBase 三個數據庫中下載miRNA 的相關基因。使用Perl 語言進行搜索，按照滿足至少存在于兩個數據庫中的標準，篩選出目標基因，并繪制韋恩圖，利用Cytoscape3.7.2 確認miRNA 與其靶基因的相關性。對靶基因取交集，用差異表達mRNA 進行處理，驗證這些靶基因在HCC中的作用。使用R 語言的“org.Hs.eg.db”和“cluster－Profiler”軟件包對所有基因進行GO 和KEGG 富集分析，調整后的P＜0.05，Q＜0.05。

1.2.5 中樞基因、與生存相關基因篩選 在String 數據庫中，將中等置信度設置為0.400，構建PPI 網絡。使用Cytoscape3.7.2 的CytoHubb 插件計算基因的度值，篩選前10 個中樞基因。同時，采用Kaplan-Meier方法，以P＜0.05 為標準，篩選出與生存相關的基因。

2 結果

2.1 miRNA 和mRNA 差異表達的檢測 根據以上標準，共鑒定出300 個差異表達miRNA，包括下調40個和上調260 個；6219 個差異表達mRNA，包括上調4870 個和下調1349 個。

2.2 三種miRNA 預后模型的構建 將原始組的miRNA（N=371）結合總生存時間隨機分為訓練組（184）和測試組（187）。訓練組采用單因素Cox 回歸（P＜0.05）得到12 個miRNA，見表1；對其進行多因素Cox 回歸分析，并構建模型。Kaplan-Meier 方法表明hsa-miR-139-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-3682-3p 是與患者總生存時間最顯著的3 個miRNA（P＜0.05），見圖1；多因素Cox 回歸系數如下：miRNA 特征性風險評分=（-0.3325×hsa-miR-139-5p 表 達）+（0.2717×hsa-miR-3682-3p 表 達）+（0.0929×hsa-miR-9-5p 表達）。

圖1 Kaplan-Meier 曲線和Log-rank 檢驗篩選出的與HCC 患者總生存期相關的miRNA

表1 單因素和多因素回歸分析的差異表達miRNA

2.3 三種miRNA 模型在三組中的總體生存預測分組 采用中位數風險評分，Kaplan-Meier 曲線顯示，在比較低風險組和高風險組時，三組的P值分別為P=1.274e-06、P=7.728e-04 和P=8.834e-09，見圖2A～圖2C）；此外，訓練組的高風險組和低風險組的5 年總生存率分別為33.5%和68.6%；測試組為28.1%和57%；原始組為31.6%和62.7%。

2.4 對三組中的三種miRNA 模型的評估 ROC 曲線結果顯示，三組的AUC 分別為0.789、0.730、0.763，見圖2D～圖2F，說明了該模型預測HCC 患者生存機會的能力。在比較這三組的兩個得分時，發現高風險得分比低風險得分的死亡率高。

圖2 三種miRNA 預后模型的驗證和評估

2.5 考慮其他臨床因素時，三種miRNA 模型的獨立性 單因素Cox 回歸分析表示，三種miRNA 模型與患者總生存時間明顯相關；而進一步的多因素Cox回歸分析證明了當考慮其他臨床信息時，三種miRNA 模型可以獨立于總生存時間，其中包括T 分期、臨床分期以及遠處轉移的存在，見表2。

表2 臨床特征的單因素和多因素回歸分析

2.6 預測這3 種miRNA 的靶基因 結果顯示，hsamiR-139-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-3682-3p 分別可以檢測到642、1314 和397 個重疊基因。其中，篩選出174 個基因作為三種已鑒定的miRNA 的遺傳靶點。為了驗證這些miRNA 靶基因是否參與了HCC 的進展，對上調miRNA（hsa-miR-9-5p、hsamiR-3682-3p）與下調的靶mRNA，以及下調miRNA（hsa-miR-139-5p）和上調靶mRNA 取交集，并進行結果分析，最終得到了174 個基因，其中包括88 個上調基因和96 個下調基因。

2.7 HCC 相關靶基因的GO 和KEGG 富集分析 通過對與HCC 相關的靶基因的GO 注釋，獲得了415個結果。在這3 類研究中，BP 分析主要包括對神經元投射發育、軸突發生和中樞神經系統神經元分化的調控。CC 分析主要包括突觸膜、突觸后特化和突觸后膜。MF 分析主要包括磷酸酯水解酶活性、DNA-結合轉錄激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ-特異性和酰胺結合。從HCC 相關遺傳靶點的KEGG 通路中獲得了6 個結果，其中超過5 個基因主要富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用的信號通路中。

2.8 來自PPI 網絡的中樞基因和與生存相關的基因目標 從174 個遺傳靶點中篩選出100 個，構成遺傳靶點的蛋白-蛋白相互作用網絡復合體，包括114 條邊和299 個節點。共篩選10 個中樞基因（ALPL、CXCL12、OIP5、TOP2A、AR、KPNA2、SLC7A2、DBT、HMGB2、MAD2L1）；其中174 個基因中有30 個基因（CDC37L、C6、C21orf91、BEND4、CEPB3、DBT、MPDZ、HS3ST3B1、GHR、ENPEP、IL33、GPR65、NSUN6、PCDHGC5、STARD5、PDK4、OGDHL、ST8SIA6、RBMS3、RNASE4、ANXA10、ACADSB、ALPL、ANGPTL1、PDE7B、ANO1、SLC7A2、NDRG2、SELP、WNT1）與生存預后正相關，17 個基因（GPSM2、EME1、COL11A1、HOXD10、LRP12、MAD2L1、KPNA2、CHST4、HMGB2、LAPTM4B、PLCB1、RAD54B、OIP5、TOP2A、TMC7、KLHL23、MEX3A）與生存預后負相關。

3 討論

肝細胞癌是一種高度惡性的腫瘤，極易發生肺（38.4%）、骨（32.6%）和淋巴結（24.6%）的轉移[7]，5年生存率僅18%，甚至約20%的患者在6 個月后復發[8]。因此，臨床迫切需要尋找具有高敏感性和特異性的生物標志物。研究顯示[9]，miRNA 可能成為腫瘤生存預后的敏感生物標志物。miR-9-5p 可以通過調控GOT1 的表達來阻礙胰腺癌侵襲、增殖、谷氨酰胺代謝和氧化還原穩態；miR-3682-3p 通過靶向肝癌中的腫瘤抑制基因GAS8，促進HCC 的侵襲和遷移[10]；而miR-139-5p 可以通過下調SLITRK4 的表達來影響HCC 細胞的侵襲和增殖能力[11]。這三種miRNA 都參與了各種腫瘤的發展調控過程，可以作為一種新的敏感生物標志物，且多種miRNA 信號比單一的miRNA 表現出更大的優勢。本研究通過單因素和多因素Cox 回歸分析構建了hsa-miR-3682-3p、hsa-miR-9-5p 和hsa-miR-139-5p 三種miRNA特征模型，與已有的研究不同，通過miRNA 分組來驗證模型的可行性。

慢性炎癥可以促進癌細胞免疫逃逸，而各種腫瘤細胞分泌的細胞因子與免疫細胞具有協同作用，可以促進腫瘤活性[12]。Han KQ 等[13]發現CXCL1RNAi可抑制腫瘤細胞的凋亡和生長，提示CXCL1 可能是治療HCC 的靶點。而生長激素可以上調小鼠肝臟中GAL1 的表達[14]，并且影響腫瘤血管的生成[15]。Boguszewski CL 等[16]的實驗也證明了在一些動物模型和與耐藥或生長激素缺乏相關的遺傳缺陷患者中，生長激素對腫瘤發生具有一定的保護作用。為了深入研究HCC 中三種miRNA 信號的調控機制，本研究利用3 個數據庫對模型中三種miRNA 的靶基因進行了評估。結果顯示，靶基因的信號通路結果主要富集于細胞因子-細胞因子受體的相互作用途徑以及生長激素的合成、分泌和作用途徑中。

為了建立調控連接HCC 的三種miRNA 模型的關鍵節點，本研究共篩選出10 個中樞基因以及47個與生存預后相關的基因；其中DBT、SLC7A2、ALPL、TOP2A、MAD2L1、OIP5、KPNA2 不 僅 是PPI網絡中的中樞基因，而且與患者的生存狀態相關。除DBT 基因缺乏相關研究外，SLC7A2 可能成為是乳腺癌的一個新的預后標志物，與強大的生存優勢密切相關[17]；ALPL 的高表達與前列腺癌生存率較差相關[18]；KPNA2[11]和OIP5[19]參與HCC 的進展及其作用機制；TOP2A 可以影響肺腺癌細胞[20]；MAD2L1 在淋巴結轉移的肺鱗癌患者表達較高，參與細胞周期的調節，可以作為非小細胞肺癌發展的預后生物標志物[21]，這6 個基因均可以作為腫瘤的預后標志物。提示這7 個基因可能成為HCC 新的治療靶點，為肝癌的治療提供一種新的思路。

綜上所述，本研究構建了能夠預測HCC 預后的miRNA 模型，分組驗證了該模型的預測能力，并且驗證了該模型可以作為HCC 中獨立預后因素。最后，通過預測miRNA 的遺傳靶點進一步了解HCC的發生和進展。