基于生物信息學方法探究ENO1基因在宮頸癌中的表達及其作用機制

王曉旋，張石云，楊益琴，陳 艷，王 淮，馬雪艷，劉云春

（1.大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000；2.云南省大理大學第一附屬醫院婦產科，云南 大理 671000；3.云南省大理白族自治州人民醫院婦產科，云南 大理 671000）

宮頸癌（cervical cancer）是常見的婦科惡性腫瘤之一，是僅次于乳腺癌威脅婦女生命健康的第二大殺手[1]。據報道，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續感染是導致宮頸癌發生的重要危險因素[2]。盡管隨著HPV 篩查項目和疫苗的普及，宮頸癌的發生率已顯著降低，但對于已經發生轉移或復發的患者來說，其預后仍較差[3]。因此，尋找更為準確且穩定的生物學靶點及其預后的評價指標具有重要的意義。α-烯醇化酶（ENO1）屬三種烯醇酶之一，廣泛存在于各種組織細胞中[4，5]，是糖酵解過程的關鍵酶之一。ENO1 不僅在糖代謝過程中發揮作用，其功能還可因其定位不同而改變，其表達水平可因病理生理、代謝途徑、生長狀態的不同而有所差異[6，7]。此外，研究表明[8，9]，ENO1 除可促進腫瘤細胞對葡萄糖和乳酸的攝取外，還可直接參與腫瘤細胞的分裂、增殖、轉移和凋亡等過程。目前，ENO1 基因與宮頸癌之間的關系尚未明確。本文將利用生物信息學方法，系統分析ENO1 基因在宮頸癌中的表達及其功能特性，旨在尋找宮頸癌的預后指標和潛在的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 ENO1 基因在宮頸癌中的表達分析 GEPIA（http://gepia.cancer－pku.cn/）數據庫[10]可對基因表達譜數據進行動態分析，此數據庫是由北京大學研究人員開發，具備基于TCGA 和GTEx 數據集提供快速且可自定義的在線分析功能。本研究借助該數據庫來分析ENO1 基因在宮頸癌與癌旁組織的表達情況，共得到兩組隊列：一組數據來源于TCGA 和GTEx 數據庫，另一組數據來源于TCGA 數據庫。將界值設定為：|Log2FC|＞1.5，P＜0.05。同時利用該數據庫中的生存分析評價ENO1 基因表達對宮頸癌患者生存預后的影響，ENO1 基因按其表達中位數分為高表達組和低表達組。

1.2 ENO1 蛋白表達分析 HPA（http://www.proteinatlas.org/）即人蛋白質數據庫，該數據庫涵蓋了蛋白組學、轉錄組學以及生物學數據，可迅速獲取某種蛋白在細胞或組織（癌和癌旁組織）的表達情況。本研究借助該數據庫檢索ENO1 基因表達情況，在搜索欄中輸入ENO1，可得到該基因在組織、細胞和腫瘤中的表達情況，分別選取宮頸癌和宮頸組織提取出該基因在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的免疫組化（immunohistochemistry，IHC）數據。

1.3 預后分析 TCGA（https://cancerge-nome.nih.gov/）數據庫[11]幾乎包含了人類所有癌癥的基因組表達圖譜，可提供所需基因組序列，并進行臨床信息下載。本研究基于該數據庫下載ENO1 基因在宮頸癌和癌旁組織樣本（共309 例）的表達譜和宮頸癌患者臨床信息（共307 例），設置過濾篩選條件：“case”“cervix uteri”“TCGA”“transcriptome profiling”“Gene Expression Quantification”及“HTSeq-FPKM”。借助perl將下載文件中探針名字轉換為基因名字，并用R 軟件包分析影響患者的預后因素。

1.4 基因富集分析 利用基因富集分析（GSEA）ENO1 基因表達水平對生物學通路基因集富集的影響。下載準備的.cls、.gct 文件并成功讀取后，按默認的加權富集統計方法進行富集分析，并將隨機組合次數設置為1000 次，選取好結果保存文件途徑，將P＜0.05 且FDR＜0.25 界定為顯著富集基因集。

1.5 基因共表達分析 Linked Omics（http://www.linkedomics.org/login.php）數據庫功能強大，可在線分析來自TCGA 數據庫的腫瘤基因譜、甲基化、拷貝數的改變、基因突變及臨床信息等。本研究采用Spearman 相關性分析篩選出與ENO1 基因共表達的基因，并將正負相關排名前50 的基因以熱圖形式展示。

1.6 統計學方法 數據下載采用R（v3.5.3）軟件處理。兩組單變量資料若符合正態分布，則采用t檢驗，否則采用秩和檢驗；采用Log-rank 檢驗計算ENO1 基因表達與宮頸癌患者預后的關系；采用Spearman 相關性分析篩選ENO1 基因的共表達基因，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ENO1 基因在宮頸癌組織和癌旁組織的表達比較 ENO1 基因在宮頸癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 ENO1 基因在宮頸癌與癌旁組織的表達比較

2.2 ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的表達比較 ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織中的染色陽性率＞75%，染色強度高，而在癌旁組織染色陽性率為25%～50%，染色強度較弱。免疫組化染色結果顯示，相較于正常組織，ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織中表達量高于癌旁組織，且主要定位于細胞質和細胞核，見圖2。

圖2 ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的表達比較

2.3 ENO1 基因與宮頸癌患者的預后分析 ENO1 基因高表達的患者生存預后差，其與患者的總生存期（OS）呈負相關（P＜0.05），見圖3。將TCGA 數據庫下載的不完整的臨床信息剔除后剩余307 例，納入Cox 風險回歸模型分析，單因素Cox 回歸分析顯示，ENO1 基因表達水平與宮頸癌患者OS 有關（P＜0.05）；多因素Cox 回歸分析顯示，ENO1 基因的表達可作為評估宮頸癌患者生存預后的獨立影響因素（P＜0.05），見表1。

圖3 ENO1 基因與宮頸癌患者OS 的關系

表1 ENO1 基因與宮頸癌患者的預后分析

2.4 ENO1 基因富集分析 ENO1 基因高表達主要富集于煙酸和煙酰胺代謝、脂肪酸代謝、過氧化物酶體等一系列與代謝相關的生物學過程，ENO1 基因可通過作用于物質代謝途徑影響細胞代謝水平進而調節腫瘤的發生發展，見表2，圖4。

圖4 ENO1 高表達的宮頸癌組織樣本的基因集富集分析

表2 ENO1 基因富集的通路集

2.5 宮頸癌組織中的ENO1 共表達基因分析 借助Linked Omics 數據庫，篩選出與該基因具有正負相關性的50 個共表達基因，并以可視化熱圖形式展示：ALDQA、NOC2L、TUBA1C 等基因與ENO1 基因表達呈正相關，且自上而下依次排列，而RNF103、MCF2L、CAPN5 等基因與該基因呈負相關，并自上而下依次排列，見圖5。

圖5 宮頸癌組織中與ENO1 基因正負相關的共表達基因

3 討論

生物信息技術在醫學研究領域的應用越來越廣泛，尤其是利用高通量、低成本的測序技術為醫學研究帶來了便利，不斷有基于大數據的新計算方法和軟件工具的出現，其可以準確快速的處理大型復雜數據集，使醫學研究得到了突飛猛進的發展[12，13]。目前，越來越多的研究人員參與癌癥機制和治療靶點的研究，借助各種在線式、交互式數據庫，分析癌癥的潛在基因靶點，并以此為契機，在細胞水平和臨床中進行驗證[14，15]。

隨著醫療水平的發展，宮頸癌的治療方法逐漸多樣化，且早期宮頸癌患者的預后已得到明顯改善，但晚期或復發的宮頸癌患者的預后仍較差。研究顯示[16，17]，宮頸癌的發病率呈逐年增長且年輕化的趨勢。一直以來，我國將細胞學篩查作為宮頸癌的主要篩查項目，雖可起到一定的早篩作用，但其敏感性仍較低，因此有必要進一步探索宮頸癌的發病機制，探索更具特異性的診斷標志物。

ENO1 基因作為代謝途徑，特別是糖代謝途徑的一種催化酶，其功能可因在細胞定位的不同、細胞內外的含量不同而發揮不同的作用。當位于細胞內時，ENO1 基因可作為糖酵解過程的關鍵酶參與糖代謝過程，也可參與腫瘤的糖代謝過程影響腫瘤的發生發展；當位于細胞膜時，ENO1 基因可作為纖溶酶原受體，通過調節纖溶酶的活性加速細胞外機制的降解過程，參與癌細胞的轉移與侵襲。ENO1 基因可參與多種惡性腫瘤的病理生理過程。有研究報道[18]，ENO1 基因可通過形成ENO1-MAPK-AKT 信號通路誘導肺癌細胞增殖分化；ENO1 基因高表達可促進肝癌細胞、胃癌細胞的增殖與遷移[19-21]，還可作為纖溶酶原受體發揮作用，促進胰腺癌細胞的侵襲[22]。

本研究顯示，ENO1 基因在宮頸癌組織中的表達水平高于癌旁組織；生存分析表明，ENO1 基因高表達與宮頸癌患者的OS 呈負相關，提示ENO1 基因高表達與宮頸癌患者預后不良有關。Cox 分析表明，ENO1 基因可作為評估患者預后的獨立影響因素。這些均提示ENO1 基因在宮頸癌發生發展過程中可作為促癌因子發揮作用，同時亦可作為宮頸癌的預后指標。本研究還顯示，ENO1 基因功能主要富集于煙酸和煙酰胺代謝、脂肪酸代謝、過氧化物酶體等一系列與代謝相關的生物學過程，推測該基因可能通過調控以上途徑來調節細胞周期，從而促進癌細胞增殖。此外，本研究還發現與ENO1 具有正負相關的共表達基因，這些數據可為后續研究奠定理論基礎。

綜上所述，ENO1 基因在宮頸癌中呈高表達，與宮頸癌的發生發展及預后存在一定關系，有望成為宮頸癌預后評估和治療的潛在靶點。