甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌的多重耐藥表型分析及抗菌中藥篩選

符冉冉，符方妹，黃寒梅，黃 聰，彭 瑋，劉 鑫

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)專業(yè)1，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室2，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院貴州中醫(yī)藥方證藥理研究特色實(shí)驗(yàn)室3，貴州 貴陽 550000）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指細(xì)菌、真菌和毒素侵入血循環(huán)，在血液中繁殖、釋放毒素和代謝產(chǎn)物，引起感染、中毒和全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起全身多器官功能障礙綜合征，是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病。近些年，由于靜脈置管、腸外給藥、機(jī)械通氣等侵入性操作及治療的廣泛開展，血流感染發(fā)生率呈逐年上升趨勢，已成為住院患者最常見的死亡原因之一[1，2]。引起院內(nèi)患者發(fā)生BSI 的重要菌群為革蘭氏陽性球菌[3]；其中，凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）分離率為50%以上[4-6]，甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌（methicillin-resistance coagulase negative staphylococci，MRCNS）在BSI 中分離率高達(dá)88.4%以上[6]，并且MRCNS 菌株表現(xiàn)為多重耐藥[7]。因此，MRCNS 的耐藥性對(duì)臨床治療提出新的挑戰(zhàn)。中醫(yī)藥用于治療感染性疾病有著數(shù)千年歷史，積累深厚，療效卓越[8]。《本經(jīng)》中記錄“連翹主寒熱，鼠痿，癰腫惡瘡，瘰疬，結(jié)熱，癭瘤”。現(xiàn)代研究表明[9]，黃連、夏枯草、大黃、魚腥草、金錢草對(duì)病原菌具有較突出的抗菌活性。此外，中藥對(duì)于多重耐藥菌也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，提示中藥對(duì)于MRSE 可能具有抗菌作用。基于此，本研究通過實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)方法獲得MRSE，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行臨床常用抗菌藥物的敏感性測定分析，進(jìn)而選取53 種中藥對(duì)MRSE 抗菌活性進(jìn)行篩選，以此指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，以及篩選出對(duì)血流感染的控制具有重要意義中藥材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株表皮葡萄球菌ATCC12228（購自中科院細(xì)胞庫）。

1.1.2 抗菌藥物 均購自北京索萊寶生物科技有限公司，具體如下：甲氧西林鈉（Methicillin sodium salt；CAS:132-92-3）、青霉素G 鈉鹽（Penicillin G Sodium salt；CAS：69-57-8）、鹽酸四環(huán)素（Tetracyclin HCl；CAS:64-75-5）、硫酸慶大霉素（Gentamycin Sulfate；CAS:1405-41-0）、鹽酸萬古霉素（Vancomycin；CAS:1404-93-9）、苯唑西林鈉（Oxacillin sodium；CAS:1173-88-2）、鹽酸克林霉素（Clindamycin hydrochloride；CAS:21462-39-5）、利奈唑胺（Linezolid；CAS:165800-03-0）；利福平（Rifampicin；CAS:13292-46-1）、替加環(huán)素（Tigecycline；CAS:220620-09-7）、左氧氟沙星（Levofloxacin；CAS:138199-71-0）、頭孢西丁（Cefoxitin；CAS:35607-66-0）、氨芐青霉素（Ampicillin；CAS:69-53-4）、紅霉素（Erythromycin；CAS:114-07-8）、氯霉素（Chloramphenicol；CAS:56-75-7）。

1.1.3 中藥材 本試驗(yàn)中53 種中藥材均購于貴州省藥材總公司，具體如下：大青葉、穿心蓮、板藍(lán)根、貫眾、野菊花、蒲公英、魚腥草、紫花地丁、土茯苓、拳參、馬齒莧、大血藤、射干、敗醬草、金銀花、連翹、青果、白花蛇舌草、黃柏、龍膽草、黃芩、秦皮、白鮮皮、苦參、鹽酸小檗堿、淡竹葉、柴胡、蒼耳子、大黃、牡丹皮、藿香、獐牙菜、鴨跖草、元寶草、馬鞭草、千里光、番瀉葉、重樓、蛇床子、牛蒡子、淡豆豉、梔子、山慈菇、百斂、馬勃、山豆根、紫草、木蝴蝶、一朵云、一點(diǎn)紅、六月雪、爵床、獨(dú)角蓮。

1.1.4 培養(yǎng)基 TSB 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基（購自北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 儀器設(shè)備 本試驗(yàn)所用儀器見表1。

表1 試驗(yàn)所用儀器

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 TSB 培養(yǎng)基的配制：準(zhǔn)確稱取TSB 30.0 g 溶解于1000 ml 重蒸水中，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min 后置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種的傳代培養(yǎng)及保存 表皮葡萄球菌于TSA平板劃線，靜置37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取單菌落于TSB培養(yǎng)基中，置37 ℃水浴震蕩搖床中培養(yǎng)12～18 h[10]。1%轉(zhuǎn)接于相同條件下再培養(yǎng)12～18 h[11]。經(jīng)活化好的細(xì)菌置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩８视捅４妫喝∨c已滅過菌的50%甘油等量的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)12～18 h 的表皮葡萄球菌于無菌的離心管中，置-20 ℃保存[12]。

1.3.3 甲氧西林對(duì)表皮葡萄球菌的MIC 測定 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）規(guī)定的肉湯稀釋法敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行表皮葡萄球菌對(duì)甲氧西林最小抑菌濃度（MIC）的測定[13]。首先，將表皮葡萄球菌接種于TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，再利用TSB 培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行稀釋至1.0×105～1.0×106cfu/ml，將細(xì)菌混懸液無菌96 孔培養(yǎng)板中，其中第1 個(gè)孔加180 μl，其余各孔加100 μl；其次，精確稱取甲氧西林溶于重蒸水中，配制為1280 μg/ml，加入到第1 個(gè)孔中，混勻，取100 μl 細(xì)菌混懸液加入到第2 個(gè)孔中，混勻，依次稀釋，至第12 個(gè)孔，最終從第12 各孔中吸取100 μl，將其棄去；最后，按照CLSI 推薦的方法，即以肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低藥物濃度，即為凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)甲氧西林的MIC，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 體外誘導(dǎo)以甲氧西林 作為誘導(dǎo)藥物，采用實(shí)驗(yàn)室體外強(qiáng)誘導(dǎo)方法獲得MRSE。首先將藥物進(jìn)行倍比稀釋，濃度從高到低依次為8MIC（4 μg/ml）、4MIC（2 μg/ml）、2MIC（1 μg/ml）、MIC（0.5 μg/ml）、1/2MIC（0.25 μg/ml）和1/4MIC（0.125 μg/ml）。然后將過夜培養(yǎng)的表皮葡萄球菌稀釋至1.0105 cfu/ml，將其接種于無菌的96 孔板中，每孔180 μl；最后將稀釋好的無菌藥物依次加入到每孔中，混勻，靜置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將菌液生長的最大藥物濃度孔定義為第一代誘導(dǎo)菌，即P1，將其作為下一代誘導(dǎo)的母菌，重復(fù)以上步驟，見圖1。對(duì)每一代誘導(dǎo)菌進(jìn)行菌株的PCR 鑒定和MIC 測定，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行-20 ℃保存。

圖1 體外誘導(dǎo)模式圖

1.3.5 耐藥菌穩(wěn)定性考察 為了考察上述獲得耐藥菌株的穩(wěn)定性，利用無甲氧西林的TSB 培養(yǎng)基對(duì)耐藥突變菌進(jìn)行連續(xù)傳10 代，依次取0、2、4、6、8 和10代的菌株進(jìn)行MIC 測定，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 耐藥菌對(duì)多種抗菌藥物敏感性測定 根據(jù)CLSI 規(guī)定的肉湯稀釋法敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[12]，以MRSE 為研究對(duì)象，測定其對(duì)卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、阿米卡星、阿奇霉素、苯唑西林、螺旋霉素、紅霉素、青霉素、頭孢西丁、氨芐青霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素、左氧氟沙星、氯霉素、利福平、利奈唑胺、克林霉素及萬古霉素的敏感性，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 中藥材水提取物制備 稱取中藥材各30 g，以5倍體積水150 ml 回流提取3 次，2 h/次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得濃縮膏后置ZK-82B 型真空干燥箱中60 ℃下濃縮至浸干得半成品，檢測后經(jīng)粉碎、過篩混合獲取干燥粉末3 g，1 g 粉末相當(dāng)于原藥10 g，低溫干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆茫唧w步驟見圖2。

圖2 中藥水提物制備流程

1.3.8 中藥水提物對(duì)甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌敏感性測定 根據(jù)CLSI 規(guī)定的肉湯稀釋法敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行表皮葡萄球菌對(duì)上述中藥水提物MIC 的測定[13]。將表皮葡萄球菌接種于TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，再利用TSB 培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行稀釋至1.0×105～1.0×106cfu/ml，將細(xì)菌混懸液無菌96孔培養(yǎng)板中。每1 個(gè)孔加100 μl，精確稱取中藥提取物0.8 g 溶于10 ml 肉湯培養(yǎng)基，配制為80 mg/ml，利用0.22 μm 的微孔濾膜對(duì)其進(jìn)行過濾，取濾好的藥液100 μl 加入到第1 個(gè)孔中，混勻，取100 μl 細(xì)菌混懸液加入到第2 個(gè)孔中，混勻，依次稀釋，至第12 個(gè)孔；從第12 個(gè)孔中吸取100μl，將其棄去；最后，按照CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)，讀取中藥水提物對(duì)MRSE的MIC。以上試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 甲氧西林對(duì)表皮葡萄球菌的MIC 根據(jù)美國CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)，表皮葡萄球菌對(duì)甲氧西林的MIC 為2 μg/ml，處于敏感水平。

2.2 甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌的獲得 通過強(qiáng)誘導(dǎo)法，利用甲氧西林對(duì)表皮葡萄球菌進(jìn)體外誘導(dǎo)，結(jié)果見圖3，在誘導(dǎo)到第21 天時(shí)，表皮葡萄球菌對(duì)甲氧西林MIC 為64 μg/ml，與誘導(dǎo)初始相比，增加了32 倍；根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判定，該菌對(duì)甲氧西林處于耐藥水平。同時(shí)，MRSE 穩(wěn)定性考察結(jié)果見圖4，表明該耐藥菌穩(wěn)定性良好。

圖3 甲氧西林體外誘導(dǎo)下表皮葡萄球菌敏感性變化

圖4 MRSE 穩(wěn)定性測定

2.3 耐藥表型試驗(yàn)結(jié)果 MRSE 對(duì)苯唑西林、青霉素G、四環(huán)素、氨芐西林藥物產(chǎn)生了交叉耐藥性，見表2。2.4 53 種中藥水提物對(duì)MRSE 的MIC 測定試驗(yàn)結(jié)果 金銀花、連翹對(duì)MRSE 的最小抑菌濃度（MIC）均為2.5 mg/ml，敗醬草、黃芩、野菊花、一點(diǎn)紅對(duì)MRSE 的MIC 為5 mg/ml，大黃、蒲公英、爵床及六月雪對(duì)MRSE 的MIC 均為10 mg/ml；其余中藥水提物MIC 均＞40 mg/ml，見表3。

表2 表皮葡萄球菌對(duì)多種抗菌藥物敏感性測定

表3 MRSE 對(duì)多種中藥水提物敏感性測定

3 討論

3.1 耐藥菌株獲得方式 目前，耐藥菌株的獲得方式主要有兩種，即臨床分離耐藥菌株和實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)獲得的耐藥菌株。其中，臨床分離具有具有典型的耐藥表型以及臨床意義，但是由于其用藥的復(fù)雜性以及不確定性，導(dǎo)致其耐藥表型的產(chǎn)生具有復(fù)雜背景，不利于交叉耐藥的研究。因此，實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)獲得耐藥菌株具有清晰的用藥背景，更適合交叉耐藥性的研究。

實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)的方式主要有兩種，一種為弱選擇壓力下的誘導(dǎo)，即將細(xì)菌處于1/8 MIC 藥物濃度下進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)；另一種為強(qiáng)選擇壓力下的誘導(dǎo)，即將每一代生長的最大藥物孔的細(xì)菌作為母菌進(jìn)行傳代，逐漸增加其藥物濃度。研究結(jié)果表明，強(qiáng)選擇壓力下細(xì)菌更容易誘導(dǎo)出高水平耐藥菌，且更容易出現(xiàn)對(duì)其他藥物的交叉耐藥現(xiàn)象，與既往研究一致[14]。本研究目的在于研究甲氧西林選擇壓力下，對(duì)多種抗生素出現(xiàn)交叉耐藥表型，通過強(qiáng)選擇壓力的誘導(dǎo)方法獲得耐藥菌株。

3.2 多重耐藥表型分析 耐藥性問題是影響抗菌藥物治療血流感染的重要因素[15]，本次試驗(yàn)研究通過對(duì)表皮葡萄球菌進(jìn)行敏感性及耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)MRSE 對(duì)苯唑西林、青霉素G、氨芐西林、四環(huán)素呈現(xiàn)多重耐藥性，與既往研究一致[16]。甲氧西林是屬于能耐青霉素酶的半合成青霉素[17]，其與臨床治療中常用的青霉素類和頭孢菌素類在結(jié)構(gòu)上存在一定相似性。因此，MRSE 對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素全都表現(xiàn)出耐藥性。

3.3 中藥水提物抗菌研究 本實(shí)驗(yàn)選取不同種類中藥對(duì)MRSE 進(jìn)行抗菌活性的系統(tǒng)篩選，分析不同類別中藥的對(duì)其抗菌活性，通過53 種中藥水提物對(duì)MRSE 的MIC 測定可知，敗醬草、金銀花、連翹對(duì)其抗菌活性較強(qiáng)；其次為野菊花、大黃以及一點(diǎn)紅；最后為黃芩、蒲公英、爵床以及六月雪。根據(jù)證治理論，抗菌中藥多集中選取清熱解毒藥和清熱燥濕藥[18]。其中，清熱解毒藥主要具有清熱解毒的作用，適用于各種熱毒病癥，如瘡癰、丹毒、斑疹、咽喉腫痛、痄腮及痢疾等[19]。現(xiàn)代研究表明，這些病癥多屬于細(xì)菌感染性疾病范疇，主要由細(xì)菌和病毒感染引起。臨床上應(yīng)用清熱解毒藥治療各種感染性疾病已屢見不鮮，而且取得一定的療效。清熱燥濕藥則是以清熱燥濕為主要功效的一類藥物，可用于治療一些細(xì)菌感染引起的痢疾、陰道炎、急性腸炎等。研究證實(shí)[20]，黃連、黃柏、黃芩、苦參、秦皮、龍膽等中藥具有不同程度的抑菌作用。此外，其余抗菌中藥可歸屬于清熱瀉火藥、解表藥、攻下藥、清熱涼血藥和化濕藥；其中部分中藥都具有一定程度的抗菌抑菌效果。

綜上所述，在甲氧西林強(qiáng)選擇壓力下，表皮葡萄球菌進(jìn)化為甲氧西林耐藥菌株；MRSE 對(duì)苯唑西林、青霉素G、氨芐西林和四環(huán)素產(chǎn)生交叉耐藥；敗醬草、黃芩、金銀花、連翹、大黃、野菊花、蒲公英、一點(diǎn)紅、爵床以及六月雪對(duì)MRSE 具有抗菌活性。