基于網絡藥理學方法探討桃紅四物湯防治股骨頭壞死的潛在分子機制

倪 杰，徐 晶，蔣 濤

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬常州市中醫醫院，江蘇 常州 213003）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head）是一種骨科常見慢性病，是指股骨頭血供受損或中斷，導致骨髓成分及骨細胞死亡，隨后發生修復，繼而導致股骨頭結構改變，甚至塌陷的一系列病理改變和臨床表現[1]。該疾病致殘率高，給患者帶來極大的經濟和心理負擔，嚴重影響患者的生活質量。隨著現代手術技術的發展，股骨頭置換術以及全髖關節置換術日益成熟，為一大部分老年股骨頭壞死患者帶來了福音，但由于人工關節使用壽命有限，青壯年患者往往需要慎重考慮。目前臨床提倡根據股骨頭壞死的程度分別施治，早期股骨頭壞死可采取藥物治療的方式，西藥主要是發揮抗凝、促纖溶、擴血管、調整破骨和成骨速率等作用，代表藥物有磷酸鹽類、低分子肝素等，但長時間使用存在的副作用不容忽視。中醫藥療法副作用小，因而有著極好的應用前景。股骨頭壞死屬中醫學“骨蝕”“骨痹”“骨萎”的范疇。現代中醫對股骨頭壞死的辨證分型中，氣滯血瘀證居于首位，因血為氣之母，氣為血之帥，氣滯則血行不暢，久則瘀阻血脈，氣血凝滯不通，不能濡養筋骨，則發此病，故行氣活血為治本病第一大法。桃紅四物湯首見于《醫宗金鑒·婦科心法要訣》，是活血化瘀的代表方劑，因其是在四物湯的基礎上加入桃仁、紅花，故名桃紅四物湯。該方既補血養血，又活血行血，是防治氣滯血瘀型股骨頭壞死的首選方[2]。多項研究表明[3-6]，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的療效確切，但具體作用機制尚不明確。網絡藥理學是依托網絡平臺，使用最新的研究數據和成果，從細胞分子層面對藥物作用于疾病的機制、過程以及相關通路進行研究的新型學科。基于此，本研究利用網絡藥理學的方法對桃紅四物湯防治早期股骨頭壞死的可能作用機制進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源 研究中使用的數據庫及軟件：中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、人類基因數據庫（The Human Gene Database，GeneCards）、在線人類孟德爾遺傳數據 系 統（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、STRING 平臺、Cytoscape 軟件、R 語言軟件、Perl 軟件。

1.2 桃紅四物湯有效成分庫及靶基因庫構建 登錄TCMSP 數據庫，分別以“桃仁”“紅花”“熟地黃”“當歸”“芍藥”“川芎”檢索藥物所含的有效成分，并進行初步篩選，條件為：口服生物利用度（OB）＞30%，生物類藥性（DL）＞0.18，構建桃紅四物湯的有效成分庫。同時，通過TCMSP 數據庫查詢桃紅四物湯有效成分的作用靶點，并通過Perl 軟件構建靶基因庫。

1.3 股骨頭壞死靶基因庫構建 以“Osteonecrosis of the Femoral Head”為關鍵詞，分別檢索GeneCards及OMIN 數據庫，合并所查得的有關股骨頭壞死的靶基因，篩選并構建股骨頭壞死有關靶基因庫。

1.4 交集基因庫構建 使用R 語言軟件及Perl 軟件，獲得桃紅四物湯靶基因與股骨頭壞死靶基因的交集基因，并繪制Veen 圖，篩選桃紅四物湯-股骨頭壞死共同靶點基因。

1.5 蛋白互作網絡（PPI）構建及核心靶基因篩選將通過上述步驟得到的桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因輸入“STRING”數據庫，選擇“Multiple Proteins Search”，限定物種為“Homo sapiens”，保存下載TSV 格式的分析結果，繪制PPI 圖，并通過R語言計算每個靶點基因的度值（即靶點基因之間的相互連接數目），取大于平均度值的靶基因為核心靶基因。

1.6 藥物成分-靶基因-疾病調控網絡的構建 利用Cytoscape 軟件對STRING 網站得到的結果與桃紅四物湯有效成分以及共同靶點基因進行分析，構建藥物成分-靶基因-疾病調控網絡，并對網絡圖中節點大小及顏色進行調整。

1.7 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析 將所得到的桃紅四物湯-股骨頭壞死共同靶標基因輸入提前編寫好的R 語言程序中，進行分析計算，得出GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析的結果。

2 結果

2.1 桃紅四物湯有效成分庫及靶基因庫 檢索TCMSP 數據庫后共得到69 個有效成分，160 個對應靶點。

2.2 股骨頭壞死相關基因庫 檢索GeneCards 數據庫以及OMIM數據庫后共得到245 個股骨頭壞死相關靶點基因。

2.3 桃紅四物湯-股骨頭壞死交集基因庫 將上述檢索得到的160 個中藥靶點基因與股骨頭壞死相關靶點基因取交集，得到39 個桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因，見圖1。

圖1 桃紅四物湯靶點基因與股骨頭壞死靶點基因交集Veen 圖

2.4 PPI 網路構建及核心靶點基因篩選 將上述得到的39 個桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因輸入STRING 數據庫，設置相關條件后運行得到靶基因PPI 圖（圖2），同時以大于平均度值為條件，篩選得到21 個核心靶點基因，見圖3。

圖2 桃紅四物湯防治股骨頭壞死靶基因PPI 圖

圖3 蛋白互作核心靶點條圖

2.5 藥物成分-靶基因-疾病調控網絡 通過Cytoscape軟件整合分析中藥桃紅四物湯的核心有效成分以及對應的藥物作用靶標基因與股骨頭壞死疾病共同基因之間的關系，構成桃紅四物湯-靶基因-股骨頭壞死疾病調控網絡，見圖4。

圖4 桃紅四物湯-靶基因-股骨頭壞死疾病調控網絡

2.6 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析 GO功能富集分析顯示，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的核心靶基因的GO 功能主要涉及細胞因子活性、DNA 結合轉錄因子結合、核激素受體結合、雌激素受體結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、激素受體結合、核受體結合、生長因子受體結合等，見圖5、圖6。KEGG 通路富集分析顯示，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的核心靶基因潛在通路共篩選得到94 條富集通路，主要涉及糖尿病并發癥的晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產物受體（receptor for AGE，RAGE）信號通路、白介素（interleukin，IL）-17 信號通路、低氧誘導因子（HIF）-1 信號通路、松弛肽信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路等，見圖7、圖8。

圖5 GO 基因本體論分析柱狀圖

圖6 GO 基因本體論分析氣泡圖

圖7 KEGG 功能富集分析柱狀圖

圖8 KEGG 功能富集分析氣泡圖

3 討論

桃紅四物湯中含桃仁、紅花、熟地黃、當歸、芍藥、川芎六味中藥，其中桃仁、紅花活血化瘀，熟地、當歸、芍藥養血補血，川芎活血行氣，六藥合用，共奏補血活血，化瘀通絡之功效，能夠促進肢體氣血循環，使“瘀去而新生”。本研究通過TCMSP 數據庫篩選，共得到桃紅四物湯有效成分69 個，靶點基因160 個；通過GeneCards 數據庫以及OMIM數據庫檢索，共得到245 個股骨頭壞死相關靶點基因，取交集后最終得到39 個桃紅四物湯-股骨頭壞死疾病交集基因，說明網絡藥理學方法在研究中藥作用于疾病機制過程中是科學而必要的，其能夠篩選出中藥作用于疾病的可能靶點基因，從而縮小中藥實驗研究的目標范圍，提高研究效率，同時也能節約科研經費和資源。

此外，本研究根據大于平均度值這一條件，篩選出了21 個核心靶點，主要有白介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子A、表皮生長因子受體、基質金屬蛋白酶等。IL-6 既是一種炎癥細胞因子，也是破骨細胞調節因子。既往研究表明[7]，IL-6 作為炎癥細胞因子，其可在人體發生感染與損傷時升高，介導炎癥反應，而作為破骨細胞調節因子，其可通過OPG/RANKL/RANK 經典通路與HIF-1 通路調節破骨細胞活性，促進骨吸收。多項研究表明[8，9]，IL-6 在股骨頭壞死患者發病機制及病情變化中可能起到最重要的作用。而抗IL-6 治療可以減少髖關節滑膜炎和骨吸收，刺激血管重建及新骨生成，增加股骨頭缺血性壞死后的骨形成[10，11]。血管內皮生長因子是一種具有重要促血管生成活性的生長因子，同時也是炎癥細胞因子和成骨細胞因子。血管內皮生長因子A 是不同類型血管內皮生長因子中促血管生成能力最強的一種，其在血管生成和新生血管生成中發揮重要作用，可引起細胞增殖、抑制凋亡、血管通透性增加、血管擴張、炎癥細胞聚集到損傷部位等[12]。多項研究發現[13-15]，使用血管內皮生長因子治療股骨頭壞死可促進骨組織重塑和骨壞死部位新骨形成。表皮生長因子是一種多功能生長因子，因其在體內具有增加骨吸收、刺激骨形成的特點[16]，故在調控骨代謝方面具有重要作用。有研究指出[17]，表皮生長因子與其表皮生長因子受體結合后能通過增加破骨細胞前體的增殖來刺激骨吸收，導致破骨細胞數量的增加，而抑制表皮生長因子受體則可誘導破骨細胞凋亡[18]。Basal O 等[19]對股骨頭髓芯減壓術聯合骨內注射人重組表皮生長因子治療早期股骨頭壞死進行研究，結果表明表皮生長因子能夠促進骨形成和微血管化。基質金屬蛋白酶是一類結構相近、功能復雜的鋅、鈣依賴性蛋白水解酶家族，參與形態發生、傷口愈合、組織修復和重建等過程[20]。基質金屬蛋白酶-9是一種細胞外基質代謝酶，在骨重塑中起重要作用，成骨細胞及破骨細胞均可分泌。研究指出[21-23]，基質金屬蛋白酶-9 與股骨頭壞死具有密切聯系，其作為明膠酶，可能通過直接參與破骨細胞的骨吸收過程，并誘導破骨細胞分化而調節骨代謝。本研究通過分析以上核心靶點，預測桃紅四物湯是通過促進血管內皮生長因子及表皮生長因子的表達，而促進局部血管生成，增加骨生成，并通過抑制IL-6 及基質金屬蛋白酶的表達降低破骨細胞活性，減少骨吸收，提升骨質量及骨密度，減少軟骨下骨塌陷。

本研究中KEGG 通路富集分析顯示，桃紅四物湯防治股骨頭壞死的核心靶基因潛在通路共篩選得到94 條富集通路，主要涉及糖尿病并發癥的AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、松弛肽信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。IL-17 及其家族在宿主抵御微生物和炎癥性疾病的發展中起到重要作用，經典IL-17 信號通路通過Act-1、TRAF6 與IL-17RA/IL-17RC 異質二聚體結合，激活多種下游通路，如TAK1、NF-κB、絲裂原激活的蛋白激酶等[24]。研究表明[25-27]，IL-17 能夠刺激小鼠成骨細胞分化、礦化和增殖，還能促進破骨細胞形成，使骨質單向沉積，促進骨形成，并且對脂肪形成有抑制作用，能誘導間充質干細胞成骨分化，從而促進骨再生和骨重塑。HIF-1 是細胞低氧狀態下調節細胞功能及穩態的核心轉錄因子，在HIF-1 家族中，HIF-1α 和HIF-1β 在人體內的表達最為廣泛，二者組成異二聚體。研究表明[28]，血管內皮生長因子是HIF-1 通路下游的主要目標基因之一，HIF-1α能通過刺激血管內皮生長因子的表達促進血管生成，進而影響骨形成。Wu J 等[29]通過給新西蘭兔注射馬血清和甲基強的松龍的基礎上行桃紅四物湯灌胃，8 周后發現兔股骨頭組織中HIF-1α 和血管內皮生長因子明顯提升。除此之外，HIF-1α 還可影響骨髓間充質干細胞的增殖和遷移。Zou D 等[30]通過慢病毒使HIF-1α 過表達，觀察其對骨髓間充質干細胞的成骨影響，結果表明HIF-1α 可以使骨髓間充質干細胞過表達成血管基因及成骨基因。Cheng MS等[31]通過對HIF-1α 過表達的骨髓間充質干細胞聯合蛋白支架修復骨軟骨缺損的作用進行研究，結果發現相較于對照組，觀察組治療13 周后缺損區的軟骨質量更好，軟骨下骨硬化程度更小，骨髓間充質干細胞存活率更高。松弛肽是胰島素超家族中的一種多肽激素，在抗纖維化、血管舒張、血管生成、抗炎、抗細胞凋亡等生理病理過程中發揮重要作用[32]，其可通過與G 蛋白耦聯受體松弛肽家族受體1 結合激活多種下游信號轉導途徑[33]。G 蛋白耦聯受體松弛肽家族受體1 不僅存在于生殖組織中，也存在于骨組織中，包括成骨細胞、破骨細胞和骨細胞[34]。Moon JS 等[35]研究發現，松弛肽可通過G 蛋白耦聯受體松弛肽家族受體1，增強和維持骨形成蛋白-2誘導的Smad 和p38 的磷酸化，協同骨形成蛋白-2增強成骨細胞分化和骨形成。PI3K/Akt 信號通路在多種細胞活動中發揮關鍵作用，調控細胞增殖、分化、凋亡和遷移[36]。研究表明[37]，PI3K/Akt 信號通路參與破骨細胞及成骨細胞的分化、增殖等過程，是調節骨代謝的重要通路。Ma J 等[38]研究表明，Trpv6 通過降低IGF-PI3K-Akt 信號通路中磷蛋白/總蛋白的比值來抑制破骨細胞形成，阻斷IGF-PI3K-Akt 信號通路可明顯減輕Trpv6 對破骨細胞形成的抑制作用。Zhai Y 等[39]研究發現，通過PI3K/Akt 信號通路激活下游相關目標，如GSK3β/β 環蛋白及Nrf-2/HO-1 等，補骨脂素能抑制骨髓間充質干細胞脂肪分化，有效增強成骨分化。AGE-RAGE 信號通路參與糖尿病并發癥的發生和發展，包括糖尿病性骨病。隨著血糖水平升高，AGE 在包括骨在內的人體組織中積累，可與其受體RAGE 結合，并通過上調NF-κB受體活化因子配體mRNA 的表達來誘導破骨細胞形成，還可通過抑制細胞生長、促進細胞凋亡、下調分化來影響成骨細胞，從而影響骨礦化[40]。Ding KH等[41]研究發現，RAGE 基因敲除小鼠的血清IL-6 及骨吸收降低，破骨細胞數減少，骨量及骨密度明顯升高。Lee EJ 等[42]研究表明，香豆素能通過抑制AGE-RAGE的相互作用，改善糖尿病患者的骨轉換和骨重建。總之，桃紅四物湯防治股骨頭壞死有著廣泛的作用對象和途徑，主要是通過激活HIF-1 信號通路，促進HIF-1α 以及VEGF 的表達，促進骨髓間充質干細胞增殖分化，表達成骨及成血管基因，達到增加局部血管生成，改善股骨頭局部血運，影響骨生成，還可通過PI3K/Akt 通路，抑制骨髓間充質干細胞成脂分化，協同增強成骨分化，同時激活松弛肽信號通路，抑制IL-17 及AGE-RAGE 信號通路，促進骨細胞分化和骨形成。

綜上所述，多通路、多靶點共同作用是桃紅四物湯防治股骨頭壞死的一大特點。但本研究僅基于大數據預測了桃紅四物湯防治股骨頭壞死的主要分子機制，未來仍需要通過大量嚴密設計的實驗證明其作用靶點及機制。