過表達(dá)乙酰肝素酶對膽囊癌細(xì)胞增殖及PI3K/AKT信號通路的影響

聞 波, 劉子祥, 張子艷, 陳佳偉, 王鄭林, 周少波

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 普外科, 安徽 蚌埠, 233000)

膽囊癌是一種侵襲性強(qiáng)、致死率高的惡性腫瘤，其早期缺乏典型的體征和癥狀，多數(shù)患者確診時已處于晚期[1-2]。目前，手術(shù)是有效的治療手段，對于不能通過手術(shù)切除的膽囊癌患者, 5年生存率僅為10%左右[3], 而化療或放療對晚期患者并未產(chǎn)生明顯的作用。膽囊癌的發(fā)生是在不同的進(jìn)化階段由連續(xù)的基因改變引起的，探索膽囊癌發(fā)病的分子機(jī)制對于建立膽囊癌新的治療途徑至關(guān)重要。乙酰肝素酶(HPSE)是一種內(nèi)糖苷酶，可特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分硫酸乙酰肝素(HS)，其與腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和化療耐藥等有關(guān)[4]。臨床研究[5-7]發(fā)現(xiàn), HPSE在乳腺惡性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤等多種腫瘤中表達(dá)升高。研究[8]表明, HPSE過表達(dá)促進(jìn)了人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD的增殖和遷移，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。研究結(jié)果[9]顯示，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號通路在大部分腫瘤細(xì)胞中呈激活狀態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。為了解HPSE過表達(dá)在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中的作用及PI3K/AKT 通路對GBC-SD細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究利用脂質(zhì)體法構(gòu)建HPSE過表達(dá)的膽囊癌細(xì)胞系GBD-SD, 應(yīng)用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002作用于GBC-SD細(xì)胞，探究其對膽囊癌細(xì)胞增殖的影響及其可能的分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人GBC-SD細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海)。胎牛血清(FBS)、培養(yǎng)基RPMI-1640購自Gibco公司, 質(zhì)粒pcDNA3.1購自北諾生物科技有限公司(中國上海), PCR引物、Prime Script one step RT-PCR試劑盒購自Fermentas公司, 胰酶、RIPA細(xì)胞裂解液購自Hyclone公司, BCA蛋白定量試劑盒、MTT試劑盒、SDS-PAGE凝膠以及ECL試劑盒均購自上海碧云天公司, Trizol 試劑、Lipo-fectamin 2000購自美國Invitrogen公司, 兔抗人HPSE、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT多抗、內(nèi)參β-actin抗體以及對應(yīng)二抗購自美國Affinity公司, LY294002購自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 GBD-SD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定: 在美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)中檢索到HPSE基因序列ID為ENSG00000225609.1, 經(jīng)過變性、退火處理將合成的單鏈DNA變?yōu)殡p鏈DNA, 將含有特定序列的pGPU6/GFP/Neo載體導(dǎo)入大腸埃希菌，在37 ℃的常溫下培養(yǎng)12 h, 提取大腸埃希菌中的質(zhì)粒，并確定該質(zhì)粒的DNA序列。成功構(gòu)建人HPSE基因過表達(dá)載體后，檢測驗證，最后將pcDNA3.1-HPSE載體轉(zhuǎn)染到GBD-SD細(xì)胞中，并用抗生素篩選得到含有重組載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染: 將GBC-SD細(xì)胞在添加10%胎牛血清的培養(yǎng)基RPMI-1640中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱CO2濃度為5%, 溫度為37 ℃。當(dāng)單層貼壁的細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時，加入胰酶于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行消化與傳代。將細(xì)胞分為GBC-SD組(HPSE正常表達(dá))和GBD-SD組(HPSE過表達(dá))。GBC-SD組不給予任何處理, GBD-SD組按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將載體轉(zhuǎn)染到GBC-SD中獲得。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測定細(xì)胞中HPSE的表達(dá): 細(xì)胞中總RNA用Trizol試劑提取，接下來將總 RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)制造商說明書，采用SYBRGreen方法通過qRT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。HPSE引物: 正向引物為5′-CCT-CAT-CCT-CCT-GGG-TTC-TC-3′, 反向引物為5′-AGG-AGG-CAT-TGC-TGA-TGA-TC-3′, β-actin引物: 正向引物為5′-AGC-GAG-CAT-CCC-CCA-AAG-TT-3′, 反向引物為5′-GGG-CAC-GAA-GGC-TCA-TCA-TT-3′。PCR熱循環(huán)的條件: 95 ℃下5 min, 接下來經(jīng)歷以下40個循環(huán)(95 ℃下45 s, 60 ℃下45 s, 72 ℃下60 s)。采用2-△△Ct法測定HPSE基因表達(dá)，所有PCR實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot測定蛋白水平: 使用RIPA裂解液分離細(xì)胞總蛋白后通過BCA法定量。按步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉(5%的脫脂牛奶)，然后將膜與兔抗人的HPSE(1∶1000)、PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)和p-AKT(1∶1 000)一抗在4 ℃下過夜。使用TBST清洗膜3次(每次清洗10 min), 而后在25 ℃下孵育二抗(山羊抗兔IgG, 稀釋度1∶5 000)60 min。最后對膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并使用Image J軟件定量條帶強(qiáng)度，每個實驗分別進(jìn)行3次。

1.2.5 細(xì)胞增殖實驗: ① MTT法。將細(xì)胞以2×103個/孔的密度接種在96孔板上，每組設(shè)5個復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h, 并向每孔中添加MTT溶液5 mg/mL, 再孵育4 h。接下來倒出培養(yǎng)基，向每孔中添加150 μL的二甲基亞砜(DMSO), 10 min后晶體全部溶解，最后測量每孔的光密度(OD)值，每個實驗進(jìn)行3次。② 集落形成實驗。將細(xì)胞以1×103個/孔的密度接種在6孔板上，每組設(shè)5個復(fù)孔，在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%FBS)中培養(yǎng)，以允許菌落形成。培養(yǎng)14 d后，采用PBS沖洗細(xì)胞集落3次，在室溫下用4%多聚甲醛固定25 min后用結(jié)晶紫染色15 min。最后，對染色的菌落進(jìn)行成像和計數(shù)以反映每組細(xì)胞的增殖能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗、單因素方差分析比較2組和多組間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPSE在膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD和GBD-SD中的表達(dá)

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)后的GBD-SD中HPSEmRNA和蛋白相對表達(dá)量較GBC-SD升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖1。

A: qRT-PCR檢測結(jié)果; B: Western blot檢測結(jié)果; C: HPSE蛋白的相對表達(dá)量。與GBC-SD比較, ??P<0.01圖1 HPSE在膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD和GBD-SD中的表達(dá)

2.2 HPSE過表達(dá)對膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果表明, GBC-SD組細(xì)胞在24、48、72 h的OD值依次為(0.32±0.03)、(0.45±0.03)、(0.63±0.02), 而GBD-SD組細(xì)胞在24、48、72 h的OD值依次為(0.49±0.04)、(0.64±0.03)、(0.87±0.04)。GBD-SD組細(xì)胞的OD值高于GBC-SD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。集落形成實驗顯示, GBC-SD組、GBD-SD組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)14 d后集落形成數(shù)分別為(69.33±2.52)、(152.33±5.13), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 提示HPSE過表達(dá)后顯著促進(jìn)了膽囊癌細(xì)胞的增殖。見圖2。

2.3 HPSE過表達(dá)對PI3K/AKT信號通路的影響

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與GBC-SD組細(xì)胞相比，GBD-SD組細(xì)胞p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)水平、p-AKT/AKT值和p-PI3K/PI3K值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 而總AKT和總PI3K蛋白表達(dá)水平無明顯變化。上述結(jié)果提示上調(diào)GBC-SD細(xì)胞中HPSE基因的表達(dá)可以促進(jìn)PI3K/AKT信號通路的活化。見圖3。

2.4 PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002對膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD細(xì)胞增殖的影響

為進(jìn)一步探索HPSE是否通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD細(xì)胞的增殖，本研究將PI3K特異性抑制劑LY294002(10 μmol/L)處理GBC-SD細(xì)胞2 d后，通過MTT法和集落形成實驗分析GBC-SD組和LY294002組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示, GBC-SD組和LY294002組中細(xì)胞的OD值分別為(0.53±0.05)、(0.32±0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。集落形成實驗結(jié)果表明, GBC-SD組和LY294002組中細(xì)胞在培養(yǎng)14 d后集落形成率分別為(64.67±3.51)、(24.33±1.53)%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測2組細(xì)胞p-AKT和AKT 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示GBC-SD組和LY294002組中細(xì)胞p-AKT/AKT分別為(0.96±0.02)、(0.57±0.06), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，抑制劑LY294002能夠抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖，HPSE促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞的增殖可能與PI3K/AKT通路有關(guān)。見圖4。

A: MTT檢測結(jié)果; B: 細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果; C: 菌落計數(shù)結(jié)果。與GBC-SD比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖2 HPSE過表達(dá)對GBC-SD細(xì)胞增殖的影響

A: Western blot檢測結(jié)果; B: p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)情況。與GBC-SD比較, ??P<0.01。圖3 HPSE過表達(dá)對PI3K/AKT信號通路的影響

3 討 論

目前，膽囊癌在膽道惡性腫瘤中所占比率約為90%, 其整體發(fā)病率約為1%[10]。積極尋找膽囊癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對于膽囊癌早期診斷、干預(yù)及治療意義重大。HPSE基因在正常人的組織內(nèi)主要分布在胎盤、淋巴器官等免疫組織，而在腫瘤尤其是惡性腫瘤組織中卻有著廣泛的分布。HPSE是唯一的一種能夠水解蛋白多糖的HS鏈的酶，其特定的糖苷鍵是細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面的關(guān)鍵組成部分[11]。腫瘤細(xì)胞突破由基底膜(BM)和ECM組成的天然屏障是其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中, HPSE對HS的降解與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及HS結(jié)合信號分子的釋放有關(guān)，可促使癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲和血管生成[12]。研究[13]表明, HPSE基因表達(dá)與胃癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤的生長有關(guān)，例如HPSE在人膀胱的尿道上皮癌中過表達(dá)，并且HPSE的表達(dá)水平與膀胱癌的復(fù)發(fā)相關(guān)[14]。BARASH U等[15]研究發(fā)現(xiàn)HPSE的過度表達(dá)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和生長，表明HPSE不僅具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞局部侵襲的酶活性，而且還促進(jìn)了膠質(zhì)瘤病灶的生長。研究[16-17]報道抑制HPSE的表達(dá)可抑制乳腺癌、肝癌、膀胱癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和黏附能力。PI-88[18]、SST0001[19]、M402[20]等HPSE抑制劑為腫瘤的治療提供了多種選擇。研究[8, 21]顯示, HPSE在膽囊癌組織中表達(dá)異常，與膽囊癌的進(jìn)展有關(guān)，作者前期研究中發(fā)現(xiàn)上調(diào)HPSE基因可以顯著促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖。但目前關(guān)于HPSE在膽囊癌增殖方面的調(diào)控機(jī)制并不明確，揭示其潛在的分子機(jī)制對膽囊癌的診斷及針對基因方面的治療具有重要意義。

A: MTT檢測結(jié)果; B: 細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果; C: 菌落計數(shù)結(jié)果; D: Western blot檢測結(jié)果; E: p-AKT/AKT值。與GBC-SD比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖4 PI3K/AKT信號通路抑制劑對GBC-SD細(xì)胞增殖的影響

近年來，研究[22-24]顯示PI3K/AKT通路是一種參與人體細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵信號通路，細(xì)胞靜止、增殖和癌細(xì)胞活力之間存在直接關(guān)系，該信號通路的過度激活已被證明有助于各種人類惡性腫瘤的增殖和進(jìn)展。當(dāng)PI3K/AKT信號通路被各種細(xì)胞因子和生長因子激活后作用于PI3K促進(jìn)二磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為三磷酸肌醇，進(jìn)而導(dǎo)致PI3K/AKT信號通路的下游作用因子AKT的激活，使得p-AKT比率升高，調(diào)控其下游分子，從而參與胰腺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤和黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程[25-28]。成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)的關(guān)鍵觸發(fā)因子。作者前期研究[8]已經(jīng)證實HPSE通過其酶活性切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的HS側(cè)鏈，刺激FGF2等生長因子和細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生EMT, 增強(qiáng)其增殖及遷移能力。有研究[29-30]分析表明HPSE的上調(diào)可顯著促進(jìn)FGF2的表達(dá), 相反，觀察到HPSE沉默介導(dǎo)FGF2的減少, HPSE能夠通過上調(diào)FGF2的表達(dá)而激活PI3K/AKT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。由此可見, FGF2是聯(lián)系HPSE和PI3K/AKT信號通路最重要的細(xì)胞生長因子，過表達(dá)HPSE可能通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

鑒于PI3K/AKT信號通路對癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，作者分析了過表達(dá)HPSE對PI3K/AKT信號通路的作用。本研究結(jié)果表明，與正常表達(dá)HPSE的GBC-SD細(xì)胞相比，過表達(dá)HPSE可顯著提高p-PI3K、p-AKT的蛋白水平并促進(jìn)了膽囊癌細(xì)胞的增殖，但PI3K、AKT總量無顯著變化，提示HPSE可以激活GBC-SD細(xì)胞的PI3K/AKT通路。為了證實上述結(jié)果，作者使用LY294002處理GBC-SD細(xì)胞，觀察到LY294002處理后對p-PI3K、p-AKT蛋白水平有明顯的抑制作用。但與未經(jīng)抑制劑處理的GBC-SD細(xì)胞相比，總PI3K、AKT的蛋白水平仍無顯著變化。由此可見，HPSE能夠促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖，而LY294002可抑制HPSE的促增殖作用。

綜上所述，本研究證實了PI3K/AKT信號通路在過表達(dá)HPSE促進(jìn)人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，為HPSE在人膽囊癌的治療提供了新的分子靶點和用藥新思路。