微小RNA-126和血管內皮生長因子在增殖性糖尿病視網膜病變患者視網膜前膜中的表達及意義

李 瑞, 李萬明, 陳小麗

(1. 北京航天總醫院 眼科, 北京, 100076; 2. 首都醫科大學附屬北京地壇醫院 眼科, 北京, 100076)

增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)是2型糖尿病患者常見的一種微血管病變，主要是由于長期慢性高血糖引發視網膜缺血，誘發新生血管異常生長及繼發性纖維組織增殖，進而促使視網膜前膜的異常增殖及纖維化，最終導致血管源性病變[1]。PDR的發病機制目前尚未完全清楚，且患者發病初期癥狀不明顯，故尋求PDR發生過程中的關鍵靶標基因具有重要意義。微小RNA(miRNAs)是一類長度為20～25個核苷酸的高度保守的內源性非編碼單鏈小RNA分子，可參與細胞增殖分化、免疫反應等多種生理及病理過程并發揮重要作用[2-4]。血管內皮生長因子(VEGF)具有誘導血管生成的作用，其高表達與PDR形成有關[5]。相關研究[6]表明，微小RNA-126(miR-126)可通過調控靶基因VEGF的表達而發揮調節血管生成的功能，且可促進新生血管的形成。本研究主要探討miR-126、VEGF在PDR患者視網膜前膜組織中的表達變化并分析其臨床意義，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2020年2月于北京航天總醫院眼科擇期行玻璃體切割手術的PDR患者65例納入研究組，另選取同期行玻璃體切割手術的特發性黃斑裂孔患者62例納入對照組。研究組中，男41例，女24例，年齡41～71歲，平均(56.12±9.33)歲，糖尿病病程為5～15年，平均(10.12±1.65)年。對照組男34例，女28例，年齡42～70歲，平均(57.03±9.52)歲。研究組納入標準: ① 符合PDR相關診斷標準[7]者; ② 反復出現玻璃體積血者; ③ 檢查出眼底出現增生膜或牽拉性視網膜脫離者; ④ 既往無眼部手術史者。對照組納入標準: 符合特發性黃斑裂孔的診斷標準且未合并其他眼部疾病者。排除標準: ① 患有其他眼部疾病者; ② 患有血液系統疾病或代謝性疾病者; ③ 合并嚴重高血壓者; ④ 近期接受抗新生血管藥物治療者; ⑤ 合并惡性腫瘤及免疫系統疾病者。2組患者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本采集[8]: 2組患者均接受常規玻璃體切割術治療。灌注前使用玻璃體切割頭抽取玻璃體液0.6 mL置于微量離心管中，手術中留取視網膜前膜組織，并轉移至-80 ℃冰箱保存備用，術中使用0.06%臺盼藍溶液幫助視網膜前膜組織的完整剝除。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測視網膜前膜組織中miR-126、VEGFmRNA表達水平: 取出凍存的視網膜前膜組織，加入細胞裂解液進行裂解，按照Trizol試劑盒(北京天根生化科技有限公司)操作步驟提取總RNA。采用miRNAs反轉錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書將RNA反轉錄為cDNA。采用聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(美國Invitmgen公司)進行qRT-PCR反應并檢測miR-126、VEGFmRNA的相對表達量，反應體系為20 μL(2×SYBR Mix 10 μL, 10×cDNA模板1 μL, 上下游引物各1 μL, H20 8 μL), 反應程序設定為94 ℃預變性1 min, 92 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 75 ℃ 30 s, 共40個循環，每個樣本設置3個平行反應復孔。在PCR儀上(Bio-Red公司)進行反應，其中引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。反應結束后對數據進行分析，其中miR-126以U6作為內參，按照2-△△Ct算法進行基因相對定量表達分析,VEGFmRNA以β-actin為內參，按照2-△△Ct算法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Western blotting法檢測VEGF蛋白表達水平: 取2組視網膜前膜組織在冰上剪成碎片并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，簡單離心后棄去PBS并加入蛋白裂解液，采用玻璃勻漿器勻漿至組織破碎，并在冰上裂解30 min, 簡單離心5 min后將上清轉移至另一EP管中即組織總蛋白產物，采用二辛可寧酸法檢測蛋白純度并取20 μg蛋白樣品于沸水中煮5 min, 之后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉移至聚偏二氟乙烯膜。封閉液封閉并加入一抗兔抗鼠VEGF多克隆抗體(1∶2 000), 室溫下靜置120 min, 清洗后加入二抗室溫孵育60 min, 再次清洗。采用電化學發光法試劑盒發光顯影并運用Quantity One(美國BIO-RAD公司)分析軟件對條帶灰度值進行分析，以β-actin為內參對顯影條帶進行VEG蛋白相對表達量的計算。

1.3 觀察指標

檢測并比較2組患者的空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)水平。2組患者檢查前1 d晚8時后禁食且不可劇烈運動，次日抽取空腹靜脈血檢測。首先檢測FBG水平，之后進行抗凝實驗，采用高壓液相法以Sysmex全自動生化分析儀(日本希森美康公司)及其配套試劑檢測HbA1c水平，將采集的血樣離心20 min取上清，檢測TG水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 視網膜前膜組織中miR-126、VEGF mRNA及蛋白表達水平比較

研究組患者視網膜前膜組織中miR-126表達水平低于對照組,VEGFmRNA及其蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 2組視網膜前膜組織中miR-126、VEGF mRNA和VEGF蛋白表達水平比較

圖1 VEGF蛋白條帶圖

2.2 FGB、TG及HbA1c水平比較

研究組患者FGB、TG、HbA1c水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3 研究組患者miR-126與VEGF mRNA的相關性及兩者與FGB、HbA1c、TG的相關性分析

Pearson相關分析法結果顯示，研究組患者視網膜前膜組織中miR-126表達水平與VEGFmRNA表達水平呈顯著負相關(P<0.05), 見圖2; miR-126與FGB、HbA1c、TG呈顯著負相關(P<0.05), 而VEGFmRNA與FGB、HbA1c、TG呈顯著正相關(P<0.05), 見表4。

表3 2組FGB、TG及HbA1c水平比較

圖2 miR-126與VEGF mRNA表達水平的相關性分析

2.4 PDR的單因素與多因素Logistic回歸分析

單因素Logistic分析顯示, FGB、HbA1c、TG、miR-126、VEGFmRNA表達水平為PDR發生的影響因素; 多因素Logistic分析顯示, miR-126、VEGFmRNA表達水平為PDR發生的獨立影響因素。見表5、表6。

表4 miR-126、VEGF mRNA與患者臨床指標的相關性分析

表5 PDR影響因素的Logistic單因素分析

表6 PDR影響因素的Logistic多因素分析

3 討 論

PDR發生機制較為復雜，可能與體內炎癥反應、慢性缺血缺氧、自由基生成、蛋白質的非酶糖基化、氧化應激反應等多種病理過程有關[9]。持續高血糖會引起血管障礙并促使視網膜血管阻塞，造成基底膜增厚而導致視網膜無灌注區缺血缺氧狀態，這一病理過程會破壞血管生成抑制因子與刺激因子的平衡并刺激新生血管生成[10]。研究[11]表明，糖尿病視網膜病變患者血清VEGF水平升高，且VEGF水平與病變嚴重程度有關。miR-126與腫瘤組織中微血管生成相關，且可通過抑制血管內皮生長因子A表達而抑制乳腺癌細胞的增殖及遷移[12]。miR-126、VEGF表達與PDR發生、發展的關系目前尚未完全明確，本研究檢測患者視網膜前膜組織中miR-126、VEGF表達水平，旨在分析其與視網膜病變的關系及臨床意義。

miR-126位于表皮生長因子結構域7的內含子6與7區域內，定位于人9號染色體，可通過誘導靶基因表達而調控信號轉導通路并在內皮細胞中發揮其生物學功能[13]。施鳳漣等[14]報道，妊娠期糖尿病患者血清miR-126表達水平較血糖正常的妊娠者低，且其低表達與胰島素抵抗有關。相關研究[15]發現，缺氧性視網膜病變模型動物的視網膜血管內皮細胞中miR-126過表達可抑制新生血管形成，且miR-126可維持血管完整性并參與視網膜病變過程。由此推測, miR-126可能參與PDR過程。本研究結果顯示，研究組患者視網膜前膜組織中miR-126表達水平顯著低于對照組，說明PDR患者視網膜前膜組織中miR-126呈低表達，且參與PDR的發生發展過程。相關研究[16]發現, FGB、HbA1c等指標與糖尿病視網膜病變的病理過程緊密相關，且與疾病嚴重程度有關，即病情越嚴重其水平越高。本研究結果顯示，研究組患者HbA1c、TG水平顯著高于對照組，與相關研究[17]結論一致。本研究還分析了PDR患者FGB、HbA1c、TG水平與miR-126表達水平的相關性，結果顯示miR-126分別與FGB、HbA1c、TG呈顯著負相關，說明miR-126不僅參與PDR病理過程，還與疾病嚴重程度緊密相關。

VEGF位于人染色體6p21.3, 可通過其特異性受體活化磷脂酶C并增加鈣離子內流而提高磷酸肌醇水平，進而促使內皮細胞增殖，有利于血管生成[18]。研究[19]表明, VEGF在多種惡性腫瘤中發揮重要功能，不僅可產生促血管生長細胞因子，還能誘導腫瘤血管生長或加快病變血管內皮細胞的增殖及遷移。相關研究[20]發現，血清VEGF水平升高參與老年糖尿病視網膜病變的發生，且VEGF水平升高可作為評價患者微血管損傷的依據。本研究結果顯示，研究組患者視網膜前膜組織中VEGFmRNA及其蛋白表達水平均顯著高于對照組，說明VEGF與PDR發展及新生血管形成關系密切。由此推測, VEGF可通過增加血管的通透性與視網膜局部新生血管的形成而參與糖尿病患者發生PDR的過程。本研究相關性分析結果顯示,VEGFmRNA與FGB、HbA1c、TG均呈顯著正相關，說明VEGF除可引起糖尿病患者發生PDR外，還與病變嚴重程度緊密相關。本研究結果還顯示, miR-126與VEGFmRNA呈顯著負相關，推測PDR患者持續高血糖不僅可直接損害視網膜血管，還可引起視網膜組織慢性缺血缺氧導致miR-126表達下調并上調VEGF，進而參與病變過程。本研究多因素Logistic回歸分析結果顯示, miR-126、VEGFmRNA表達水平均是糖尿病患者發生PDR的影響因素。由此提示, miR-126低表達可誘導VEGF高表達而改變PDR患者眼部正常組織結構及功能，并進一步促進病情惡化, miR-126、VEGF均可參與PDR的發生發展。

綜上所述, PDR患者視網膜前膜組織中miR-126表達下調,VEGFmRNA表達上調，兩者呈顯著負相關且共同參與疾病的發生發展。檢測患者miR-126、VEGFmRNA和其蛋白表達水平，有助于及時診治，進而防止病情惡化。本研究存在不足之處，如未檢測血清和玻璃體中miR-126、VEGF表達水平，也未探討miR-126與VEGF在PDR發生過程中的具體調控機制，有待未來進一步深入研究加以探討。