羌活-獨活治療膝骨關節炎的作用機制

吳鵬 時孝晴 廖太陽 王培民 張農山 黃正泉 丁亮 邢潤麟 茆軍

南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京210029

膝骨關節炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種以膝關節疼痛、活動受限、僵硬甚至畸形為主要癥狀的慢性退行性骨關節疾病[1]。患者年輕化、發病率逐漸上升，使KOA已成為全球范圍內的公共衛生問題[2]。目前，無論是藥物還是手術治療均具有一定局限性，中醫藥在KOA的治療上歷史悠久、副作用較少、療效確切[3]。羌活-獨活二者經常被用于風寒濕引起的關節疼痛、風濕骨病[4]。羌活辛、苦，性溫，辛溫解表、散寒止痛、通利關節，為治療風寒濕痹之要藥，獨活辛、苦、微溫，祛風除濕、疏經通絡、通痹止痛，能散在里之伏風，二者一上一下，一表一里，相須為用。二者作為藥對出現最早記載于《外臺秘要》：羌活行上焦而理上……獨活行下焦而理下……二者配伍，直通上下，橫行肢臂、腰膝、治各類風寒濕痹皆可[5]。但中藥成分復雜，具體作用機制還需進一步研究，借助現代網絡藥理學，探討羌活-獨活藥對治療膝骨關節炎的作用機制，為其治療KOA提供有力的理論支撐，有助于中醫藥的現代化。

網絡藥理學通過分析藥物、基因和蛋白的相互作用，發現其相互作用網絡，這與中醫藥的“整體觀、系統觀”十分契合[6-8]，目前，網絡藥理學已被廣泛運用于中藥藥理機制研究、藥物重新定位、毒副作用等相關研究[9-11]。本研究擬通過網絡藥理學，探討羌活-獨活治療KOA的潛在作用靶標和信號通路，為羌活-獨活治療KOA提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 篩選羌活-獨活活性成分

通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)以“羌活，獨活”為關鍵詞檢索所有化合物活性成分信息，篩選條件：藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥ 0.18，篩選出羌活-獨活活性成分[12-14]。

1.2 篩選羌活-獨活和KOA相關靶點

通過GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets和DrugBank 數據庫，以“Knee osteoarthritis”為關鍵詞，檢索與KOA相關的基因，通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)將上述獲得的羌活-獨活作用靶標轉化為對應的基因名稱，再將羌活-獨活活性成分的靶點預測結果與檢索出的KOA相關靶標進行匹配，篩選交集靶點，確定羌活-獨活治療KOA的核心靶點，通過Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。

1.3 構建羌活-獨活活性成分與KOA作用靶點網絡

將篩選出的12個羌活-獨活活性成分和16個KOA的相關靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件構建羌活-獨活活性成分與KOA靶點網絡[15]。

1.4 構建蛋白互作網絡(PPI)及篩選核心基因

將上述羌活-獨活的蛋白靶點導入String數據庫(https://string-db.org/)，設置物種：Homo sapiens，置信度：0.4，繪制PPI網絡，通過拓撲分析篩選關鍵靶點，使用R project軟件制作顯示基因名和與其相連節點數的條形圖。

1.5 GO和KEGG富集分析

使用RGUI和org.Hs.eg.db將所得到的羌活-獨活治療KOA潛在靶點轉化為entrezID后再使用RGUI、DOSE和ClusterProfiler對相關靶點進行GO和KEGG富集分析。選擇富集程度最高的前20條通路。

1.6 分子對接

使用Discovery Studio 2016 3.0對羌活-獨活活性成分與3個KOA核心靶點通過分子對接進行間接驗證。羌活-獨活類藥成分與KOA作用靶點分別通過Chemical Book數據庫和PCSB PDB數據庫獲取。將上述獲得的靶蛋白進行去水、加氫等處理，保存為對接受體。使用LibDock模塊進行分子對接，保存各圖像。通過LibDock score結果評價活性成分和關鍵靶點之間的對接效應，LibDock score 分數越高表明配體與受體蛋白結合性越好。

2 結果

2.1 羌活-獨活活性成分

在TCMSP數據庫中根據OB≥ 30%，DL≥ 0.18的原則下篩選出羌活-獨活15種活性成分，最終納入12個有效活性成分，詳見表1。

2.2 羌活-獨活活性成分與KOA作用靶點的構建

通過TCMSP平臺篩選出羌活-獨活中分成35個有效活性成分作用靶標，在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets和DrugBank 數據庫中檢索到1 952個與KOA相關靶點，映射后得到16個共同靶基因，韋恩圖見圖1，羌活-獨活活性成分靶標見表2。

表1 TCMSP中篩選羌活-獨活的活性成分

圖1 羌活-獨活成分與KOA靶點韋恩圖Fig.1 Venn map of ingredient of ligustrilucidi-Notopterygium incisum-Angelica pubescens-KOA

表2 羌活獨活治療KOA潛在靶點信息

圖3 羌活-獨活治療KOA潛在核心靶點Fig.3 Potential core targets for Notopterygium incisum-Angelica pubescenstreating KOA

2.3 羌活-獨活活性成分與KOA靶點網絡的構建

將12種活性成分與16個KOA相關作用靶點進行映射后導入Cytoscape 3.8.0構建羌活-獨活成分-KOA靶點網絡，見圖2。

圖2 羌活-獨活成分-KOA靶點網絡Fig.2 Ingredient of Notopterygium incisum-Angelica pubescens-target network of KOA注：藍色長方形：中藥名稱；紅色菱形：疾病名稱；黃色橢圓形：藥物有效成分；綠色橢圓形：疾病作用靶標。

2.4 核心靶點篩選

將16個關鍵靶標導入STRING數據庫，PPI網絡顯示其中16個節點，43條邊，將TSV數據導入Cytoscape，基于度中心性(degree centrality，DC)、介數中心度(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)使用CytoNCA對上述數據進行分析，刪除2個孤立點，對剩下的14個節點進行第1次篩選，DC≥ 6.000，BC≥ 0.619，CC≥ 2.767，網絡顯示共有5個節點，10條邊，再對這5個節點進行第2次篩選，DC≥ 9.000，BC≥ 0.765，CC≥ 21.867，網絡顯示共有3個節點，3條邊，最終得到的JUN、PTGS2、CASP3為核心靶點，見圖3。

2.5 GO和KEGG通路富集分析

GO分析顯示羌活-獨活能夠參與核受體的活動、配體激活的轉錄因子活性等相關過程，見圖4。KEGG富集分析顯示主要與細胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信號通路密切相關，見圖5。

圖4 羌活-獨活活性成分潛在治療KOA靶點的GO功能分析Fig.4 GO biological process enrichment analysis of Notopterygium incisum-Angelica pubescens against KOA

圖5 羌活-獨活活性成分潛在治療KOA靶點的KEGG富集分析Fig.5 KEGG signaling pathway of Notopterygium incisum-Angelica pubescens against KOA

2.6 分子對接分析

分子對接結果顯示，羌活-獨活活性成分與篩選出的JUN、PTGS2、CASP3均能較好對接，與網絡藥理學篩選結果相吻合，間接驗證了羌活-獨活能夠調節KOA的核心靶點。配對結果見表3，部分對接過程見圖6。

3 討論

KOA作為一種慢性、高致殘性疾病，給患者及社會帶了沉重的經濟負擔，現已成為醫學領域亟待解決的公共健康問題。疼痛是KOA最常見的癥狀，超過65 %的KOA患者以疼痛為最主要表現。多數就診的KOA患者表示疼痛是影響其生活質量的重要原因，控制疼痛是其最主要的就診目的[16]。對癥狀性的KOA患者，口服或局部使用非甾體類抗炎藥或曲馬多是常見的診療手段[17]。但不可否認的是，盡管西藥的運用獲得了一定的成效，但遠期臨床療效仍難盡人意。與此同時，非甾體類抗炎藥在治療

表3 配體受體蛋白分子對接情況Table 3 Molecular docking of Ligand receptor protein

圖6 羌活-獨活活性成分和KOA靶點beta-sitosterol對接過程Fig.6 The docking process of active ingredient of Notopterygium incisum-Angelica pubescens with beta-sitosterol of KOA targets注：a～c依次為CASP3、JUN、PTGS2與beta-sitosterol對接過程。

KOA的同時，還會引起胃腸道及心血管等方面的副作用[18-19]。

在祖國醫學中，KOA屬于“痹癥”范疇，《素問·痹癥》記載到：風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，大多數KOA患者為老年人，年老體弱，肝腎不足，氣虛虧虛，不足以濡養經脈，再加上風、寒、濕三邪入侵，寒濕凝滯，氣血淤阻，不通則痛[20]。中醫藥具有多通路、多靶點、多途徑的作用特點，對復雜性疾病往往能更好的發揮治療作用。網絡藥理學作為一種藥物研究策略，在中醫藥的研究中已得到廣泛應用，有利于我們更好的了解藥物及其化合物的作用[21]。此外，分子對接有助于揭示藥物與靶點之間的關系。

羌活-獨活對KOA的治療療效顯著，然而分子層面的相關研究相對缺乏。因此，在本研究中，結合拓撲分析和分子對接策略，通過構建和分析目標網絡，對目標進行富集分析，揭示潛在機制。本研究篩選出了羌活-獨活的12個活性成分和16個防治KOA的作用靶點。有研究[22]顯示，羌活-獨活聯用較單味藥能更減緩佐劑關節炎大鼠的足趾腫脹，提高機械刺激疼痛閾值，抑制炎癥因子的分泌。其中歐前胡素抗炎鎮痛作用已得到廣泛研究[23-25]。異歐前胡素能夠抑制脂多糖刺激的RAW264.74小鼠巨噬細胞NO的釋放[26]。佛手柑內酯對大鼠成骨細胞的增殖和分化具有促進作用[27]。香葉木素可以改善KOA軟骨細胞變形，增加軟骨細胞數量，能夠緩解軟骨細胞凋亡和免疫反應[28]。由此可見羌活-獨活能夠多通路、多靶點治療KOA。

富集分析顯示，羌活-獨活能夠參與半胱氨酸型內啡肽酶活性參與凋亡過程，核受體的活動、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性等相關通路，與細胞的增殖、凋亡和調控細胞代謝密切相關。KEGG富集分析顯示相關通路主要包括細胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信號通路。CASP3、CASP8、CASP9和PTGS2都是與凋亡密切相關的蛋白酶，CASP3不僅能夠激活CASP6、CASP7和CASP9，還能調控細胞的遷移、侵襲，在KOA中與軟骨的退變和軟骨細胞凋亡關系密切[29-31]。BAX主要位于細胞質，能夠釋放下游凋亡因子，當BAX過表達會抑制BCL-2的活性，促進細胞凋亡[32-33]。JUN是激活蛋白1的亞單位之一，JNK受刺激后能促進JUN磷酸化，擴大炎癥反應[34]。AR是一種配體依賴性反轉錄調節蛋白，雄激素能夠通過AR干預細胞免疫和細胞因子起到抗炎作用[35-36]。ESR1是一種配體依賴的轉錄因子，常表達于軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞以及骨髓基質細胞等，雌二醇靶向ESR1能夠抑制ERK信號通路，激活自噬，抑制凋亡，調控軟骨細胞增殖[37]。正常軟骨中沒有NOS2表達，當NOS2受到相關刺激則能升高NO，增加對軟骨的破壞[38]。

綜上，本研究運用網絡藥理學的方法，對“羌活-獨活”治療KOA的作用機制進行了探究，同時通過分子對接將核心靶點與關鍵成分進行對接驗證，間接證實了本研究的準確性和可靠性。通過分析，篩選出羌活-獨活12種活性成分和16個潛在作用靶點，初步推測羌活-獨活可能通過歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、香葉木素、谷甾醇等有效活性成分調控CASP3、JUN、CASP8、AR等靶點調節細胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信號通路，抑制炎癥，干預細胞凋亡過程，從而起到治療KOA的作用。本研究初步闡釋了羌活-獨活治療KOA的合理性，為羌活-獨活治療KOA提供了理論依據和新的方向。