豨薟草對膠原誘導性大鼠關節炎的治療作用

賈永利 楊新明 張培楠 孟憲勇 胡長波 陰彥林

河北北方學院附屬第一醫院骨外科，河北 張家口 075000

類風濕關節炎是以滑膜炎為特征的慢性系統性疾病，隨著疾病的加重，可破壞關節軟骨、關節囊，導致關節畸形和喪失功能[1]。目前治療類風濕關節炎以減少患者活動從而控制關節損傷、防止功能喪失，達到緩解疾病目的，但現實生活中很多患者無法做到減少活動[2]，導致治療受到影響。豨薟草具有祛風除濕、清熱解毒、抗炎鎮痛等功效，在臨床上應用于關節疼痛、急性腸炎等治療，可緩解關節炎中炎癥因子水平，從而抑制疾病發展[3]，但具體機制尚不清楚。白細胞介素(interleukin，IL)-23/輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)介導的B細胞促炎性機制與關節炎關系密切，對類風濕關節炎的發生、發展至關重要[4]。但尚未發現豨薟草與IL-23/Th17的相關研究，推測豨薟草可能通過IL-23/Th17炎癥軸影響類風濕關節炎。因此，本研究擬通過建立膠原誘導關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，采用豨薟草灌胃，探討豨薟草對CIA治療的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：40只雄性SD大鼠均購自山東大學實驗動物中心，SPF級，6周齡，體重(205±10)g，動物生產許可證號：SCXK(魯)2019-0001，動物使用許可證號：SYXK(魯)2019-0005，動物質量合格證號：NOD2019061327。所有大鼠均在河北北方學院附屬第一醫院動物實驗室飼養，在溫度23 ℃～25 ℃、濕度50 %的環境中自由飲水、攝食暫養1周后，開始實驗。本研究經河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會審核并通過，倫理審批號：2020-101479。實驗嚴格遵守3R原則。

1.1.2主要藥物、試劑與儀器：牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex公司，批號：20021；冰醋酸、弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司，批號：L2880、F5881；豨薟草來自本院中藥房；IL-23重組質粒由艾美捷科技有限公司合成；蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)試劑盒購自北京索萊寶公司，批號：G1120；大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自英國abcam公司，批號：ab119545、ab204522、ab222503、ab223857、ab100707；抗CD3-PE、抗CD8-FITC、PE-IL-17、PE-IgG1購自美國eBioscience公司，批號：22-0308-72、25-5273-42、210-17、25-4888-82；總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，批號：DP477；cDNA第一條鏈合成試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，批號：11102-C；熒光定量PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，批號：BTN12-284。DMM-400C型顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司；Attune NxT型流式細胞儀、ProFlex?型實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)儀均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備：將牛Ⅱ型膠原提前用冰醋酸溶解，4 ℃保存過夜備用。將豨薟草提前在40 ℃烘干后碾碎成粉，經3號篩過濾后加入10倍水，在80 ℃水中浸泡30 min，提取2次，過濾后棄去濾渣，留濾液濃縮至100 mL，放置室溫后,2 000 r/min離心10 min，取上清液，質量濃度調整為250 g/L備用。IL-23重組質粒經過純化并鑒定。將30只大鼠根據參考文獻[5]建立CIA模型，弗氏完全佐劑：牛Ⅱ型膠原溶液=1∶1，在冰浴中充分乳化，配置成混合液，腹腔注射10 %水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，在大鼠(右后趾、尾、背)部多點注射混合液，每只注射0.3 mL。另外10只大鼠作為陰性對照組，在相同部位注射等體積生理鹽水，14 d后進行相同操作，再二次免疫3～7 d，模型大鼠足趾腫脹明顯，關節炎指數明顯增加，即為模型成功。模型成功后的大鼠按隨機數表法分為模型組、豨薟草組、豨薟草+IL-23組，每組10只。豨薟草組給予灌胃2 g/kg豨薟草提取物[6]，1次/d，連續灌胃7 d；豨薟草+IL-23組在給予灌胃2 g/kg豨薟草提取物的同時，經尾靜脈注射IL-23重組質粒，只在灌胃豨薟草提取物第1天時經尾靜脈注射IL-23重組質粒一次，豨薟草提取物灌胃1次/d，連續7 d；陰性對照組、模型組均灌胃等體積的生理鹽水和經尾靜脈注射相同體積生理鹽水。

1.2.2樣本收集：實驗結束后觀察大鼠形態并稱量體質量，檢測大鼠足趾腫脹度、關節炎指數，經腹主動脈采血后，立即處死大鼠，取滑膜組織，部分置于40 g/L多聚甲醛中固定，部分置于- 80 ℃冰箱中保存。

1.2.3大鼠足趾腫脹度、關節炎指數測定：運用水容積法測定大鼠左后足的容積，即足趾腫脹度。大鼠關節炎指數采用5級評分法[7]，根據關節紅腫、腫脹情況評定，0分：無紅腫、無異常；1分：趾關節紅腫；2分：趾關節和足趾腫脹；3分：踝關節以下均腫脹但不變形；4分：踝關節及以下腫脹明顯，關節變形嚴重。大鼠所有關節炎指數之和即為每只大鼠關節炎指數。

1.2.4HE染色檢測滑膜組織形態學情況：滑膜組織經多聚甲醛固定過夜后，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，浸蠟，石蠟包埋，切片(厚度6 μm)。石蠟切片在90 ℃中烘箱中烘30 min，經二甲苯脫蠟后放入乙醇中脫水，蒸餾水中洗滌，將蒸餾水洗滌過的切片移入蘇木精液中5～10 min，細胞核染色，自來水洗去切片上殘余染液，將切片放入1 %鹽酸乙醇液中褪色，切片變紅、顏色變淺即可，3～10 s，1 %氨水中反藍，蒸餾水浸片，經0.5 %伊紅酒精溶液染色2～5 min、細胞質染色，乙醇脫水、二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.2.5ELISA檢測大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量：將大鼠腹主動脈血以3 000 r/min離心10 min，收集血清；滑膜組織加入9倍體積的等滲鹽水碾碎后以10 000 r/min離心20 min收集上清，96孔板包被緩沖液稀釋過的大鼠IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21抗體、4 ℃過夜，倒掉包被液，緩沖液清洗；通過樣品稀釋液稀釋IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21標準品和樣品，每孔加100 μL標準品或樣品，室溫孵育2 h，洗板，每孔加入HRP標記過的稀釋過的IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21單克隆抗體100 μL、室溫孵育1 h，洗板，每孔加樣品稀釋液稀釋過的酶、室溫孵育1.5 h，洗板，每孔加100 μL反應底物、室溫避光反應30 min，每孔加50 μL反應終止液，450 nm處測定吸光值。根據標準品繪制標準曲線，計算待檢樣品濃度。

1.2.6流式細胞術檢測Th17細胞百分比：將2 mL腹主動脈血經肝素鈉抗凝后，通過密度梯度離心法分離單個核細胞；將滑膜組織剪碎，用RPMI-1640培養液將滑膜組織制成懸液，均將細胞密度調整為1×106個/mL。加入刺激劑后，加入抗CD3-PE、抗CD8-FITC，溶血，破膜通透，加入PE-IL-17及同型對照PE-IgG1，流式細胞儀檢測Th17細胞百分比。

1.2.7RT-qPCR檢測IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平：將腹主動脈血、滑膜組織分別提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒反轉錄成cDNA，β-actin作為內參基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。RT-qPCR上樣體系20 μL，包括cDNA(50 ng/μL)1 μL、正向引物/反向引物(均為10 μmol/L)0.5 μL /0.5 μL、2×SYBR qPCR Mix 10 μL、ddH2O 8 μL；反應條件包括94 ℃、60 s；95 ℃、30 s(IL-23 58 ℃ 30 s、IL-17 58 ℃ 30 s、IL-6 56 ℃ 40 s、IL-22 61 ℃ 35 s、IL-21 59 ℃ 40 s)，40個循環。通過2-ΔΔCt法計算IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21相對表達水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 四組大鼠體質量比較

模型組大鼠出現食欲不振、困倦癥狀；豨薟草組大鼠上述癥狀有所緩解。與陰性對照組[(347.45±15.49)g]相比，模型組[(275.95±14.51)g]大鼠體質量降低(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組[(315.44±22.19)g]大鼠體質量升高(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組[(286.18±21.47)g]大鼠體質量降低(P<0.05)。

2.2 四組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數的比較

造模成功率為100%。與陰性對照組相比，模型組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數升高(P<0.05)。見表2。

表2 四組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數的比較

2.3 四組大鼠滑膜組織形態學情況

陰性對照組滑膜細胞排列整齊、疏松，滑膜細胞間膠原間質明顯，無炎癥浸潤現象；模型組細胞排列紊亂、無規律可循，炎癥現象明顯，成纖維細胞增生明顯，可觀察到炎癥、纖維蛋白滲出物；豨薟草組滑膜細胞重新出現膠原間質，炎癥現象明顯減少；豨薟草+IL-23組相較于豨薟草組有炎癥細胞增多趨勢。見圖1。

圖1 四組大鼠滑膜組織形態學情況(標尺：200 μm)Fig.1 Histomorphology of synovial membrane of rats in 4 groups (scale: 200 μm)

2.4 四組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比比較

與陰性對照組相比，模型組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比升高(P<0.05)。見表3。

表3 四組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比比較

2.5 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比比較

與陰性對照組相比，模型組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比升高(P<0.05)。見表4。

2.6 四組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

與陰性對照組相比，模型組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)。見表5。

表4 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量及Th17細胞百分比比較

表5 四組大鼠腹主動脈血中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

2.7 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

與陰性對照組相比，模型組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組相比，豨薟草組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平降低(P<0.05)；與豨薟草組相比，豨薟草+IL-23組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平升高(P<0.05)。見表6。

表6 四組大鼠滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 mRNA水平比較

3 討論

類風濕關節炎屬自身免疫疾病，病理表現為滑膜炎，炎癥刺激可導致骨質吸收和骨形成平衡被打破，從而導致骨和軟骨被破壞，大量炎癥細胞因子參與骨質丟失過程[8]。在CIA模型中關節腫脹、滑膜組織增生、部分組織缺氧、炎癥細胞浸潤、成纖維細胞樣滑膜細胞異常增生導致軟骨侵蝕、骨骼破壞現象[9]。本研究發現，模型組大鼠出現食欲不振、困倦癥狀，且大鼠體質量下降，提示CIA影響大鼠食欲、體重、精神狀態；足趾腫脹度、關節炎指數升高，提示大鼠足趾、關節炎癥嚴重，從而導致疾病發生；進一步HE染色發現滑膜組織中細胞排列紊亂、炎癥現象明顯，成纖維細胞增生明顯，可觀察到炎癥、纖維蛋白滲出物，提示大量炎癥現象導致骨和軟骨破壞、骨質丟失，成纖維細胞增生明顯導致滑膜增生與凋亡失衡，細胞因子失衡導致病變持續進展。在治療上西醫采用抗炎鎮痛、關節內注射玻璃透明質酸或糖皮質激素、全關節置換術等，但近期及遠期療效欠佳，未能從根本上緩解疾病。而中醫在類風濕關節炎中的治療表現出了優勢[10]。

類風濕關節炎屬中醫痹癥范疇，《素問·痹論》云：“黃帝問曰：痹癥安生？岐伯對曰：風寒濕三氣雜至，合而成痹也”，且古代醫者認為外邪侵襲、三焦阻滯，肺腑虧虛、三焦氣化失常，濕氣均為類風濕關節炎的主要機制，因此治療上以汗而發之，利其小便，溫陽化氣、調補腎脾肺[11]。豨薟草性味歸經，歸肝、腎經，具有行痹止痛、郁而化熱之功效[12]，在臨床上能夠降低活性氧和抑制氧化應激從而減輕炎癥通路表達，通過抗氧化、抗炎作用用于治療類風濕關節炎[13]。本研究發現，與模型組相比，豨薟草組食欲不振、困倦有所緩解、體質量升高，足趾腫脹度、關節炎指數下降，滑膜組織中炎癥浸潤現象、成纖維細胞增生現象得以緩解，提示豨薟草可能通過減輕炎癥現象、緩解成纖維細胞增生現象從而行痹止痛、郁而化熱，達到緩解足趾腫脹、關節炎癥狀，從而達到治療疾病目的。

IL-6、IL-23可刺激T細胞上特定結合受體，誘導CD4+T細胞分化為高致病性的Th17[14]。Th17作為輔助T細胞，可分泌IL-17、IL-22、IL-21等促炎因子，在自身免疫疾病發生中起重要作用[15]。其中IL-17作為T細胞誘導的最早啟動因子，可促進前炎性因子的釋放進而誘導炎癥因子水平增加，可介導中性粒細胞誘發滑膜炎癥反應[16]；而刺激IL-17表達后又可影響多條信號通路促進T細胞和上皮細胞激活，從而產生更多的IL-6、IL-23等炎癥因子[17]。在類風濕關節炎中IL-23、IL-17、IL-6、IL-1、IL-33水平升高，且與疾病嚴重程度、臨床癥狀評分關系密切，可將炎癥因子作為診斷、評估疾病和治療的標志[18]。本研究發現，與陰性對照組相比，模型組腹主動脈血、滑膜組織中IL-23、IL-17、IL-6、IL-22、IL-21含量和mRNA水平以及Th17百分比均升高，提示在CIA血液和滑膜組織中機體處于紊亂狀態，IL-6、IL-23處于激活狀態可刺激Th17分化，促進IL-17分泌，而IL17作為前促炎因子促進促炎因子IL-22、IL-21等釋放；同時IL-17亦可促進IL-6、IL-23的分泌，從而促進IL-23/Th17過程，級聯放大促進滑膜組織炎癥，加速疾病進程。與模型組相比，豨薟草可抑制IL-23/Th17過程，從而減輕炎癥反應，實現對疾病的緩解。而在豨薟草基礎上添加IL-23重組質粒可逆轉豨薟草對疾病的緩解作用，提示豨薟草在類風濕關節炎中是通過抑制IL-23/Th17炎癥軸進而緩解疾病。

綜上所述，豨薟草可通過抑制IL-23/Th17炎癥軸從而抑制炎癥反應，起到對類風濕關節炎的治療作用。但中藥豨薟草成分復雜，亦可能通過其他信號通路發揮作用，對于這方面有待開展進一步的研究、探索。