淫羊藿苷與雌激素對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

高巳東 鄧洋洋 王重一 林浩楠 林庶茹

遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847

絕經后骨質疏松癥[1](postmenopausal osteoporosis，PMOP)屬于Ⅰ型原發性骨質疏松癥。PMOP好發于絕經后5～10年之間[2]，是由于骨吸收與骨生成之間平衡受到破壞，成骨因子合成量減少，骨礦含量低下，導致骨密度下降[3-4]。

淫羊藿入肝、腎經，為補腎陽、強筋骨、祛風濕之要藥。《中國藥典》標注，淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿中含量最高的單體[5]，其含量至少為0.5 %[6]。分子式呈植物雌激素樣結構[7]。因ICA療效明顯，易獲取，且基于雌激素-ERα軸探討應用植物雌激素ICA與激素替代療法對比的相關研究較少，遂選擇ICA進行本次實驗。本研究將對比補腎填精中藥單體ICA與雌激素替代療法促進BMSCs向成骨分化及對內環境雌激素(estrogen，E2)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料：SD大鼠BMSCs(凍存代次P2)購自賽業(蘇州)。

1.1.2主要實驗試劑：SD大鼠骨髓間充質干細胞培養液、茜素紅(賽業，中國)；雌二醇、淫羊藿苷(上海源葉，中國)；大鼠ALP、E2 ELISA試劑盒(聯碩生物，中國)；羅丹明標記鬼筆環肽(索萊寶，美國)；ERα抗體(三鷹，中國)；FITC標記山羊抗兔IgG(EARTHOX，美國)。

1.1.3主要實驗儀器：IX71 型倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；CO2培養箱(Thermo，美國)；Infinite M200 型多功能酶標儀(TECAN，奧地利)；BL610/BL1500 電子天平(賽多利斯，中國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養：將大鼠BMSCs接種于含體積分數為10 %胎牛血清的培養基中，置于37 ℃、5 % CO2培養箱內靜止培養。觀察細胞生長至對數時期時，進行傳代培養。本次實驗選取第3、4代。將細胞分為正常組、E2組、ICA組和E2+ICA組。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖：根據前期實驗積累，將總質量20 mg、分子量為676.65的ICA溶解于DMSO中，配制濃度為10-6mmol/L。將總質量100 mg、分子量為272.382的17β-E2溶解于DMSO中，配制濃度為10-8mmol/L。將消化后的細胞反復吹打混勻，以5×108/孔為標準，均勻鋪滿96孔板。培養24 h，將原有培養液吸走，再加入培養液(含體積分數為0.5 %胎牛血清)繼續培養24 h。將原有培養液吸走，加入含藥培養液，設置正常組、E2、ICA組、E2+ICA組，共計4組，每組6個復孔，干預24、48、72 h。然后，按照試劑盒說明書加入MTT溶液，培養1 h。將96孔板放入酶標儀中，用570 nm波長檢測吸光度。

1.2.3茜素紅染色：將BMSCs反復吹打混勻，用24孔板設置細胞為 5×104個/孔均勻鋪板，每組4個復孔，分別培養6、12、18 d。觀察細胞狀態后棄培養液，用PBS洗滌細胞兩次，多聚甲醛浸泡30 min固定形態，再用PBS清洗兩次，滴入茜素紅染液避光染色30 min，置于37 ℃、CO2培養箱內靜置。染色后用PBS沖洗2次。待表面水汽蒸發完全后，鏡下觀察視野內礦化結節。

1.2.4ELISA法檢測ALP[8]、E2[9]活性：取各組細胞上清液，置于- 80 ℃保存；運用ELISA試劑盒對ALP、E2檢測，標準曲線制備及樣品測定方法按照說明說操作。在490 nm的波長處檢測OD值，根據標準曲線計算各孔濃度。

1.2.5ERα免疫熒光染色：在24孔板中，每孔放入枚爬片，再設置BMSCs為5×104個/孔均勻鋪板,每組4個復孔，分別培養6、12、18 d。爬片用 PBS 洗滌兩次，在室溫下用4 %多聚甲醛固定15 min，將細胞與ERα抗體(1∶200)一起孵育過夜。與FITC標記山羊抗兔IgG (1∶500) 孵育2 h，加羅丹明標記鬼筆環肽對細胞骨架染色，DAPI復染細胞核。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察染色的ERα。細胞中ERα的表達量用ImageJV1.8.0.112軟件進行分析統計。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞增殖功能

將各組細胞分別培養24、48、72 h，E2組和ICA組的OD值在48 h時到達峰值，隨后降低；E2+ICA組在72 h時到達峰值，但該組48 h與72 h相差不明顯；細胞增殖24 h時，E2組增殖量高于ICA組，48、72 h的結果顯示ICA組增殖量高于E2組，且在48 h時ICA組高于E2+ICA組，見圖1。

圖1 MTT增殖與活力檢測表Fig.1 The MTT proliferation and viability detection table 注：與正常組同一時間比較，**P<0.01；與組內不同時間比較：與24 h組比較，○○P<0.01；與48 h組比較，△P<0.05。

2.2 ELISA法檢測ALP、E2

2.2.1ALP活性檢測：檢測各組在6、12、18 d 時的ALP活性，隨著培養時間延長而發生變化，相同時間點各給藥組ALP活性從小到大依次為ICA組

2.2.2E2活性檢測：根據ALP結果，檢測各組在 12 d 時E2活性，各給藥組E2活性從低到高依次為：正常組

表1 不同時間各組ALP活性比較

表2 各組細胞E2活性比較

2.2.3茜素紅染色結果：BMSCs誘導12 d，經茜素紅染色后光鏡下觀察礦化結節(+)，大小不等，分布不均，各組礦化結節數量有所不同(圖2)。各給藥組礦化結節數量均多于正常組(A)，數量從少到多，依次為ICA組(C)< E2組(B)< E2+ICA組(D)。與ALP活性結果趨勢一致。

圖2 各組茜素紅染色結果Fig.2 Results of alizarin-red staining in each group注：A：正常組；B：E2組；C：ICA組；D：E2+ICA組。

2.2.4ERα免疫熒光染色：通過免疫熒光技術[10]對細胞骨架(紅色)、ERα(綠色)和細胞核(藍色)進行染色，觀測正常組、E2組、ICA組和E2+ICA組的ERα表達量及其亞細胞的定位改變(圖3、圖4)。結果顯示，ERα在成骨細胞中主要分布于細胞質內，與正常組相比，各給藥組細胞核內ERα的分布增多，核內的基因轉錄隨之增加。數量從少到多，依次為ICA組

圖3 免疫熒光染色法檢測ERαFig.3 Immunofluorescence staining method to detect ERα

圖4 各組ERα平均熒光強度Fig.4 Average fluorescence intensity of ERα注：與正常組比較，**P<0.01；與E2組比較，○P<0.05，○○P<0.01；與ICA組比較，△△P<0.01。

3 討論

3.1 “腎精”“內環境雌激素水平”與PMOP的關系

近代研究[11]表明，PMOP誘因除年齡因素外，雌激素缺乏、ER相關蛋白表達水平下降在PMOP發病機制中至關重要。雌激素與維生素 D、鈣及其他激素一起，在體內進行有效地分解并參與骨重建。其中，雌激素的骨保護作用主要由雌激素受體α介導[12]。在雌性小鼠中，雌激素-ERα軸的激活對于皮質骨和小梁骨的擴張、成骨細胞成熟至關重要[10,13-14]。

《黃帝內經》提到“二七天癸至，...，月事以時下”“女子七七，...，天癸竭，地道不通”，天癸與女子月事息息相關，也可反映腎中精氣盛衰。腎精充，天癸至，女子初潮；腎精衰，天癸竭，女子絕經。PMOP可引起骨質、骨量及骨功能的異常。中醫將“腎、骨、髓”組成了一個相互關聯的系統。其根本在于腎，以腎藏精，灌輸、濡潤、滋養骨腔腦髓。骨作為“靶器官”，與腎中精氣關系密切。維系腎與骨之間的中間精微物質則是髓液，為腎精所化生。PMOP的發生與中醫腎精虧虛，雌激素異常相關。

3.2 雌激素替代療法與植物激素應用的比較

眾所周知，絕經后婦女雌激素缺乏會導致PMOP的發生。研究[3,15]表明，雌激素替代療法(estrogen replacement therapy , ERT)能夠治療因雌激素水平缺乏引起的PMOP相關癥狀，但ERT同時也存在弊端，如造成肥胖、高血糖，甚至引起乳腺癌、心血管疾病及血栓等嚴重副作用。與ERT相比[16]，植物雌激素或植物來源的異種雌激素同樣具有緩解PMOP相關癥狀的功能。植物雌激素最大的優點在于通過雙向調節以維持雌激素含量升降平衡，具有更安全、高效、全面的特性。

3.3 ICA對內環境雌激素水平、ALP的影響

補腎填精中藥單體ICA屬于植物雌激素，可促進BMSCs向成骨分化[11]。ICA的藥效反應更快、毒性更小、短期藥效水平維持良好，本研究僅進行單藥最佳濃度1∶1配合應用，也為后續探討根據藥物反應時效調整不同時間段的用藥比例以發揮最佳藥效提供了實驗基礎。ALP是成骨細胞的一種早期特征性生物標志物[17]，可進一步促進成骨細胞礦化。對比各給藥組E2活性與ALP活性趨勢，盡管單純補充雌激素療法可以更顯著地提高細胞內雌激素含量，但ICA在促進BMSCs向成骨分化以防治骨質疏松癥的同時，又能將內環境雌激素的含量趨于正常標準，以此規避ERT的副作用，效果良好。

綜上所述，根據中醫理論“腎藏精主骨”，腎精充足，骨骼強健，補腎填精中藥單體ICA可以通過提高ERα核內表達，增加ALP含量，維持正常雌激素水平。能夠用于治療雌激素缺乏為主的PMOP，亦可為絕經后雌激素分泌異常導致的其他慢性病提供新靶點和新思路。