高效液相色譜一步法快速測定10種有機酸

張艷艷，孫曉康，張曉元，袁丹丹，劉英梅，趙國敏，劉 飛

（山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

有機酸是一類含有羧基的化合物，是食品中酸味的主要來源，廣泛存在于水果、蔬菜和加工食品中。果蔬中的有機酸影響果蔬的色、香、味和果蔬制品的穩定性[1]；食品中的有機酸可調節口味，改善食品風味，影響食品的質量和口感[2]，加工制品中的有機酸可抑制有害菌，延長其保質期[3]。因此在產品的質量管理、生產中，有機酸的檢測必不可少[4]。

有機酸檢測方法通常采用氣相色譜法（GC）[5]、離子色譜法（IC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7-9]等。其中因HPLC法操作簡單、準確度高等優點，應用最廣泛，且可同時測定多種有機酸。果蔬、中藥及益生菌發酵果蔬汁飲品中的乙酸、草酸對其口感有一定影響。現行食品安全國家標準[10]食品有機酸（GB 5009.157-2016）測定中，可同時測定6種有機酸的含量，但并沒有對草酸、乙酸、丙酮酸等有機酸的檢測。本實驗通過摸索優化實驗方法，建立同時開展10種有機酸定性定量HPLC分析方法，靈敏度高，重復性好，對食品加工過程中控制有機酸含量、調節風味、穩定食品品質具有指導性意義。

1 材料

1.1 材料

酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸、戊二酸（色譜級，Sigma）；草酸二水合物（分析純，阿拉丁）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；純凈水（娃哈哈）；KH2PO4、磷酸（分析純，國藥集團）；果汁飲品（實驗室自制）。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Legend micro 21R低溫高速離心機（Thermo）；BSA1245電子天平（賽多利斯）；KQ-600E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GM-0.33A隔膜真空泵（天津津騰）；S201K pH計（梅特勒）。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 儲備液配制 精確稱取0.7 g草酸二水合物、0.125 g酒石酸、0.5 g丙酮酸、0.25 g蘋果酸、0.5 g乳酸、0.5 g乙酸、0.25 g檸檬酸、0.625 g丁二酸、0.01 g富馬酸、0.5 g戊二酸，分別用純凈水溶解，定容至5 ml，配成100 mg/ml草酸、25 mg/ml酒石酸、100 mg/ml丙酮酸、50 mg/ml蘋果酸、100 mg/ml乳酸、100 mg/ml乙酸、50 mg/ml檸檬酸、125 mg/ml丁二酸、2 mg/ml富馬酸和100 mg/ml戊二酸標準儲備液。置于棕色瓶4 ℃儲存。

2.1.2 標準溶液配制 采用0.1 %磷酸按照一定比例稀釋對應的有機酸儲備液，分別配成0.05 mg/ml草酸、0.5 mg/ml酒石酸、0.1 mg/ml丙酮酸、1 mg/ml蘋果酸、2 mg/ml乳酸、1 mg/ml乙酸、1 mg/ml檸檬酸、2.5 mg/ml丁二酸、0.01 mg/ml富馬酸、2 mg/ml戊二酸標準溶液；將有機酸儲備液按一定比例混合，0.1 %磷酸定容至100 ml，配制混合標準溶液，使單獨的標準溶液和混合標準溶液中同種類的有機酸的濃度相同。置于棕色瓶4 ℃儲存。

2.2 色譜條件的選擇

采用色譜柱：ZORBAX SB-Aq （250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；根據10種有機酸的分離情況，確定流動相中KH2PO4溶液（磷酸調pH 2.7）的濃度、甲醇含量以及色譜柱的柱溫。

2.3 精密度實驗

取有機酸標準溶液200 μl，按照2.2項優化后的色譜條件進行HPLC檢測，連續上樣6次，通過分析各有機酸的峰面積，計算峰面積的相對平均偏差（RSD）。

2.4 回收率實驗

有機酸混合標樣中添加已知濃度的有機酸標準溶液，按照2.2項優化后的色譜條件進行HPLC檢測，每個樣品重復上樣6次，通過峰面積，計算各有機酸平均回收率及回收率的RSD。

2.5 果汁飲品有機酸檢測

取果汁飲品1 ml，10000 r/min離心2 min，取上清，采用0.1 %磷酸稀釋10倍，0.45 μm尼龍膜過濾，按照2.2優化后的色譜條件HPLC檢測，連續上樣3次。

3 結果與分析

3.1 色譜條件對有機酸組分分離效果的影響

3.1.1 流動相中KH2PO4溶液濃度的選擇 在酸性環境中，有機酸較穩定且易被分離，參考色譜柱對pH和鹽濃度的耐受范圍，選擇pH 2.7條件下，KH2PO4溶液濃度分別設定為5，10，20，30和40 mmol/L，結果表明，40 mmol/L KH2PO4溶液濃度條件下，蘋果酸和丙酮酸有效分離，其他濃度下蘋果酸和丙酮酸的峰型均有不同程度的重疊。

3.1.2 流動相中甲醇含量的選擇 相同濃度KH2PO4溶液中添加不同的甲醇含量對有機酸的分離較為明顯，添加甲醇濃度分別設定為2.5 %，5 %，10 %，15 %。結果表明，5 %甲醇含量條件下，各峰型分離效果最好，甲醇含量高于5 %時，乳酸、檸檬酸、乙酸峰型有部分重疊。

3.1.3 色譜柱柱溫的選擇 固定流動相，調節色譜柱柱溫箱的溫度為25，30，35，40 ℃。綜合分離度和保留時間，結果表明，30 ℃時各有機酸之間的分離效果最佳。

3.2 有機酸標準曲線的建立

3.2.1 標準曲線的建立 綜合上述實驗結果，高效液相檢測條件，流動相采用40 mmol/L KH2PO4溶液（磷酸調pH 2.7）:甲醇=95:5，柱溫30 ℃；檢測時間10 min。有機酸樣品單獨進樣確定各有機酸的分離時間。混合標準溶液經0.1 %磷酸梯度稀釋后進樣，以有機酸濃度（mg/ml）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線如表1所示，進行線性回歸，10種有機酸標準曲線相關系數均大于0.999。有機酸混合標準溶液色譜圖見圖1。

表1 10種有機酸混合標準溶液標準曲線

圖1 10種有機酸混合標準溶液色譜圖

3.2.2 精密度實驗 采用上述高效液相檢測條件，計算同一濃度的混合標準溶液連續進樣6次的各有機酸峰面積的RSD，結果見表2，各有機酸峰面積的RSD為0.82 %～2.6 %，說明該檢測方法精密度良好。

表2 10種有機酸峰面積的RSD

3.2.3 回收率實驗 上述高效液相檢測條件，10種有機酸的回收率及相對平均偏差見圖2，結果表明，平均回收率均在94 %以上，RSD不超過4 %。證明該方法的準確率較高，可用于樣品有機酸的檢測分析。

圖2 10種有機酸回收率

3.2.4 果汁飲品有機酸檢測 果汁飲品的有機酸樣品，按照3.2.1項的檢測方法進行HPLC檢測，每個樣品檢測3次，取平均值，對各樣品中所含的有機酸進行數據分析，結果見表3。共檢出8種有機酸，其中草酸含量最高，可達4.75 g/L，各有機酸含量RSD小于0.5 %，可用于樣品有機酸檢測。

表3 自制果蔬汁中有機酸種類及其含量

4 結論

本研究確定了可同時檢測草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸和戊二酸的HPLC方法，實現了同時對10種有機酸的有效快速分離，對比GB5009.157-2016食品中有機酸的測定方法，本文中的方法測定種類更多，用時更短。方法精確度的RSD為0.82 %～2.6 %，平均加標回收率（n=6）均在94 %以上。為檢測水果、中藥等有機酸的豐富度提供快速有效方法；對于食品加工過程中有機酸含量的控制、風味調節、穩定食品品質提供指導性意義，具有實用價值。