三七紅曲復方制劑遺傳毒性評價

馬 會，高 梅，李 雪，趙文靜，英 永

（山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

近年，中藥及其復方的安全性越來越受到重視，特別是復方中藥毒性復雜，一些不合理的配伍還會產生增毒作用或新的毒性物質[1]。三七紅曲復方制劑是以三七和紅曲粉為主要原料，經科學配方制成的一種調節血脂的保健食品。三七中含有活性成分三七總皂苷，被廣泛用于心腦血管系統疾病[2-3]。紅曲粉含有活性成分洛伐他汀，具有降血脂的藥理作用[4-8]。由于紅曲霉在發酵過程中可能產生桔霉素，而桔霉素被證實具有致畸性，因而使紅曲的安全性受到關注[9]。目前三七和紅曲的毒理學研究資料相對較少，更未見有紅曲與三七配伍后復方的遺傳毒性研究。因此，本研究參照食品安全國家標準GB 15193系列標準[10-12]及《保健食品及其原料安全性毒理學檢驗與評價技術指導原則》（2020年版）[13]對三七紅曲復方制劑進行了Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠睪丸染色體畸變試驗，以評價其安全性，為臨床使用提供重要參考依據。

1 材料

1.1 實驗動物、菌株

動物：SPF級KM小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，體重28～33 g，6～7周齡，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2016-0011；動物飼養于SPF級飼養室，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2018 0031，飼養室溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。

菌株：鼠傷寒沙門菌TA97a、TA 98、TA100、TA102和TA1535，購自美國Moltox公司。

1.2 樣品與試劑

三七紅曲復方制劑（山東省藥學科學院提供，批號為180901）；疊氮鈉（山東西亞化學試劑有限公司，批號為S7470）；4-硝基喹啉-N-氧化物（Sigma-Aldrich公司，批號為WXBC7389V）；2-氨基芴（Sigma-Aldrich公司，批號為STBF2332V）；1,8-二羥基蒽醌（Sigma-Aldrich公司，批號為WXBB7902V）；環磷酰胺（Sigma-Aldrich公司，批號為C0768）；絲裂霉素C（Roche公司，批號為10107409001）。

1.3 儀器

HFsafe-1500TE生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；SPX-250B-Z生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；SSW-600-2S電熱恒溫水槽（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）；XK97-A菌落計數器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；Nexcope生物顯微鏡（耐可視中國營業總部）；AUW120D電子分析天平（日本島津有限公司）。

2 方法

2.1 Ames試驗

在有和無代謝活化系統系統（±S9）條件下，采用標準平板摻入法進行試驗。正式試驗前，對所用菌株進行了組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷鑒定、uvrB修復缺陷型鑒定、R因子（抗氨芐青霉素）鑒定、四環素抗性鑒定、自發回變菌落數鑒定和陽性誘變劑敏感性鑒定，經鑒定合格。三七紅曲復方制劑設5個劑量組，第一次試驗劑量為5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿，第二次試驗劑量為5000，1000，200，40，8 μg/皿，兩次均設置溶媒對照組和陽性對照組。在2 ml頂層培養基中，分別加入測試菌液0.1 ml、樣品溶液0.1 ml（活化時再加S9混合液0.5 ml），混勻后迅速倒入底層培養基平皿內，轉動平皿使頂層培養基均勻分布在底層培養基上，平放固化。將培養皿倒置于37±1 ℃培養48 h，觀察結果。

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

將檢疫合格的50只KM小鼠隨機分為溶媒對照組（純水）、三七紅曲復方制劑低、中、高劑量組和陽性對照組（環磷酰胺，40 mg/kg），每組10只，雌雄各半。試驗采用最大劑量法進行，低、中、高劑量分別設計為2，4，8 g/(kg·d)-1。各組均按照20 ml/kg體積灌胃給予相應溶液，每日1次，連續灌胃2 d，末次給藥后6 h取胸骨制備骨髓涂片，甲醇固定、Gimesa染色后鏡檢，每只動物計數200個紅細胞以確定嗜多染紅細胞（PCE）占總紅細胞（PCE+NCE）的比例，計數2000個嗜多染紅細胞以測定有微核率嗜多染紅細胞頻率。

2.3 小鼠睪丸染色體畸變試驗

將檢疫合格的25只雄性KM小鼠隨機分為溶媒對照組（純水）、三七紅曲復方制劑低、中、高劑量組和陽性對照組（環磷酰胺，40 mg/kg），每組5只。試驗采用最大劑量法進行，低、中、高劑量分別為2，4，8 g/(kg·d)-1，給藥容積為20 ml/kg，每日灌胃給藥1次，連續5 d，各組動物在第14天腹腔注射秋水仙素（劑量為6 mg/kg）溶液，3～5 h后取兩側睪丸，經低滲、固定、離心、滴片制備標本。Gimesa染色后鏡檢，每個動物計數100個中期分裂相細胞，計算細胞畸變率。

2.4 數據統計

3 結果

3.1 Ames試驗結果

在有和無代謝活化系統的條件下，5種菌株陽性對照組的回復突變菌落數均高于相應溶媒對照菌落數的兩倍以上，有顯著性差異（P≤0.05），表現出預期陽性結果。洪齊之康膠囊在5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿劑量下和在5000，1000，200，40，8 μg/皿劑量下的回變菌落數與溶媒對照組比較均無顯著性增加（P＞0.05），且無劑量反應關系，其中2500，5000 μg/皿劑量組的平皿有沉淀產生，但不影響計數。兩次試驗結果均表明該樣品無誘導組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌基因突變作用。結果見表1、表2。

表1 Ames試驗結果（第1次，±s，n=3）

表1 Ames試驗結果（第1次，±s，n=3）

注：*P≤0.05 vs 溶媒對照組；①4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿）；②疊氮鈉（1.5 μg/皿）；③絲裂霉素C（0.5 μg/皿）；④2-氨基芴（10 μg/皿）；⑤1,8-二羥基蒽醌（50 μg/皿）；⑥環磷酰胺（200 μg/皿）

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535(-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9溶媒對照組 153.7±11.7 174.3±178.0 25.0±2.6 28.3±7.6 148.3±22.5 166.7±22.3 213.3±9.3 280.3±27.0 15.7±3.1 13.3±7.6陽性對照組 370.3±43.1*①組別/μg·皿-1 283.7±19.8*⑥312.5 167.7±10.6 162.3±18.1 20.7±4.9 28.3±7.6 148.7±9.3 160.0±25.5 218.7±14.7 271.3±16.6 13.3±3.8 15.0±9.0 625 174.0±9.2 165.7±11.6 25.3±0.6 21.3±2.1 129.7±12.5 164.3±17.7 215.3±3.2 277.0±31.8 13.0±5.3 19.7±5.5 1250 153.3±13.9 167.7±9.0 22.0±3.5 22.0±1.0 141.3±30.9 152.7±27.1 209.3±11.0 275.3±14.3 10.7±1.2 12.3±4.2 2500 143.0±8.9 152.0±3.6 21.3±5.5 25.7±3.1 121.7±5.0 126.7±6.1 206.3±7.8 242.3±18.0 8.7±2.3 15.3±4.9 5000 150.3±11.0 154.67±8.0 20.0±4.4 21.0±2.0 135.0±12.8 148.7±14.7 209.3±5.9 260.0±16.5 9.0±2.0 14.0±3.6 2149.3±221.9*④386.7±32.3*①3248.0±304.0*④866.7±157.2*②1594.7±201.3*④1117.3±44.1*③1253.3±232.0*⑤816.0±213.3*②

表2 Ames試驗結果（第2次，±s，n=3）

表2 Ames試驗結果（第2次，±s，n=3）

注：同上

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535(-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9溶媒對照組 160.3±9.8 153.7±9.2 20.3±1.2 22.3±2.1 137.0±19.5 160.7±20.3 229.7±4.0 247.0±17.1 13.7±2.1 17.3±1.5陽性對照組 397.3±99.9*①組別/μg·皿-1 285.0±24.8*⑥8 162.7±8.6 152.7±4.5 21.0±1.0 23.0±2.0 143.0±18.5 157.7±16.2 223.7±8.5 243.7±12.9 12.0±2.6 15.0±1.0 40 146.3±10.2 157.0±7.5 21.0±3.0 21.7±0.6 131.7±21.0 160.7±17.6 216.7±16.0 253.3±8.0 12.3±1.5 13.0±3.0 200 160.3±7.6 163.0±7.9 25.0±2.6 22.7±3.8 131.7±7.1 160.0±19.5 213.7±12.9 247.3±10.2 13.0±1.7 16.0±4.4 1000 137.7±20.2 156.3±16.6 23.7±3.2 25.0±3.6 161.0±4.6 154.0±17.0 222.0±5.2 233.7±15.4 11.7±1.5 14.7±5.7 5000 135.7±10.4 142.3±10.6 22.0±3.6 23.0±4.4 147.7±6.1 154.0±11.3 222.7±20.6 240.7±11.5 11.7±3.1 13.3±4.2 504.0±25.0*④284.3±37.2*①3355.3±522.3*④1496.0±81.2*②1869.3±473.6*④1045.3±128.3*③1333.3±124.3*⑤973.3±275.1*②

3.2 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

陽性對照組的PCE/（PCE+NCE）比值與溶媒對照組比較無統計學差異（P＞0.05），微核率有顯著統計學差異（P≤0.05），說明試驗系統可靠。三七紅曲復方制劑各劑量組的PCE/（PCE+NCE）比值和微核率與溶媒對照組比較無統計學差異（P＞0.05），未見骨髓細胞抑制毒性誘導微核升高的作用，試驗結果為陰性。結果見表3。

表3 小鼠骨髓微核試驗結果（±s，n=5）

注：*P≤0.05 vs 溶媒對照組；PCE：嗜多染紅細胞；NCE：正染紅細胞。

組別 劑量/g·kg-1 微核率/ ‰ PCE/（PCE+NCE）雌性 雄性 雌性 雄性溶媒對照組 / 2.19±0.84 1.99±0.71 0.64±0.05 0.69±0.06低劑量組 2 2.08±0.42 1.88±0.70 0.68±0.03 0.63±0.02中劑量組 4 2.16±0.87 2.58±0.94 0.67±0.05 0.64±0.05高劑量組 8 1.99±0.61 1.89±0.42 0.66±0.04 0.70±0.07陽性對照組 0.04 18.08±4.13* 19.14±1.70* 0.62±0.04 0.64±0.13

3.3 小鼠睪丸染色體畸變試驗結果

與溶媒對照組比較，陽性對照組的斷裂、缺失、相互易位、有著絲點環狀染色體、單價體、細胞畸變率均有統計學差異（P＜0.05），三七紅曲復方制劑各劑量組的斷裂、缺失、相互易位、環狀染色體、單價體、細胞畸變率均無統計學差異（P＞0.05），試驗結果為陰性，結果見表4。

表4 小鼠睪丸染色體畸變試驗結果（±s，n=5）

表4 小鼠睪丸染色體畸變試驗結果（±s，n=5）

注：*P≤0.05 vs 溶媒對照組

組別 溶媒對照組 低劑量組中劑量組高劑量組 陽性對照組劑量/g·kg-1 / 2 4 8 0.04動物只數 5 5 5 5 5觀察細胞數目 500 500 500 500 500畸變率/% 1.80±0.45 1.80±0.84 2.00±0.71 2.20±1.30 12.80±3.11*畸變類型斷裂 3 2 1 6 18*缺失 1 1 1 2 7*有著絲點環 1 2 1 2 8*無著絲點環 0 0 1 0 1微小體 2 2 3 0 0非特定型變化 2 0 0 1 1相互易位 0 2 3 0 31*裂隙 2 1 6 2 8性染色體單價體 2 3 3 7 13*常染色體單價體 1 0 2 2 12*

4 討論

三七紅曲復方制劑是由三七和紅曲組成的復方中藥，其作用機制及成分間的相互作用較復雜，且紅曲中可能會伴有毒性雜質——桔霉素，增加用藥風險。三七作為傳統藥材，其遺傳毒理學資料多為活性成分的研究，結果均為無潛在的遺傳毒性[14-16]。紅曲的毒性研究多關注在桔霉素的影響，有文獻報道[17-18]，并不是所有的紅曲菌株均產生桔霉素，即使產生也僅在發酵晚期。此外，紅曲的毒性研究文獻表明未見其有遺傳毒性作用[19-20]。為充分考察三七紅曲復方制劑是否具有遺傳毒性，本研究選擇遺傳毒性組合試驗進行，包括Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、睪丸染色體畸變試驗。Ames試驗是應用最廣泛的檢測基因突變的體外試驗，具有快速、方便、靈敏性好等特點[21]。骨髓細胞微核試驗可檢測染色體或有絲分裂是否受到損傷，是評價哺乳動物體細胞遺傳毒性的細胞水平手段，睪丸染色體畸變試驗是從染色體水平評價生殖細胞遺傳突變的可能性[22-23]。

參照《保健食品及其原料安全性毒理學檢驗與評價技術指導原則》（2020年版）和食品安全國家標準[10-13]，Ames試驗采用推薦的最高劑量5 mg/皿，在首次試驗的312.5～5000 μg/皿劑量范圍內和重復試驗的8～5000 μg/皿劑量范圍內均未發現受試菌株的回復突變菌落數有劑量依賴性增加，判定結果為陰性。小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠睪丸染色體畸變試驗均采用最大灌胃劑量法，受試樣品在2～8 g/kg劑量范圍內對小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核率和睪丸染色體的形態變化無明顯影響。以上結果表明三七紅曲復方制劑無誘發基因突變及染色體損傷的作用。

綜上，在本試驗條件下，三七紅曲復方制劑作為保健食品無潛在的遺傳毒性。