響應(yīng)面法優(yōu)化三叉苦黃酮提取工藝及抗氧化活性分析

羅桂花，林翠清，肖鸕華，方 媛，莫穗芬，楊惠琳，嚴(yán) 萍＊，詹若挺

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006，2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)） 國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

三叉苦[Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley]為蕓香科蜜茱萸屬植物，嶺南本草著作《山草藥指南》是對三叉苦最早記載的著作，主要作為地方藥材被廣泛應(yīng)用，其用藥部位廣泛，包括枝、根、莖、葉。三叉苦又名三丫苦、三叉虎，主要產(chǎn)于我國廣東、廣西等地區(qū)[1]。據(jù)《中藥炮制學(xué)詞典》記載，三叉苦味苦性寒，有清解熱毒,祛風(fēng)除濕,消腫止痛之效。目前已經(jīng)具有相關(guān)臨床基礎(chǔ)，市場上主要用于乳癖安消膠囊、三九胃泰、三九感冒靈等多種中成藥。三叉苦中所含化學(xué)成分主要為黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油、色烯等[2]，且三叉苦總黃酮具有較好的抗炎及抗氧化活性[3-4]。三叉苦作為廣東省常用的藥食同源植物，食用價(jià)值較高，已被廣泛用于制作涼茶[5]。目前對于三叉苦提取的研究報(bào)道更多集中于抗炎作用[6]，為更好地開發(fā)利用三叉苦總黃酮類成分抗氧化作用，本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對三叉苦總黃酮的單因素考察結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，為該藥的開發(fā)研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑

所用藥材于2016年3月采自廣東河源，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院詹若挺研究員鑒定為蕓香科蜜茱萸屬植物三叉苦Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley的干燥帶葉嫩枝。

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201409），供UV測定含量為92.6 %；無水三氯化鋁（批號(hào)：K1505035，阿拉丁）；無水乙酸鈉（批號(hào)：J1523067，阿拉丁）；冰醋酸（批號(hào)：H2004148，阿拉丁）；L-抗壞血酸（維生素C，批號(hào)：SLBS0712V，Sigma）；DPPH（批號(hào)：STBG8547，Sigma-Aldrich）；ABTS（批號(hào)：SLBK9616V，SIGMA）；過硫酸鉀（K2S2O8，批號(hào)：L1509054，阿拉丁）；PBS pH 7.4緩沖液（批號(hào)：8120122，Gibco）。

1.2 儀器

搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺林大機(jī)械有限公司）；萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；離子酸度計(jì)（pH計(jì)，Thermo）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）。

2 方法

2.1 三叉苦總黃酮提取方法比較

2.1.1 加熱回流法 精密稱取三叉苦藥材粉末1 g置入錐形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min后稱重，加熱回流提取30 min后補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液即得三叉苦提取液。

2.1.2 超聲提取法 精密稱取三叉苦藥材粉末1 g，置入錐形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min后稱重，超聲提取30 min后補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2 三叉苦總黃酮回流提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱取三叉苦藥材粉末1 g，置入錐形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min之后稱重，加熱回流提取30 min后補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液即得到三叉苦提取液。

2.2.2 對照品溶液制備 稱取蘆丁對照品適量，加入甲醇制成每1 ml含0.2 mg蘆丁對照品溶液，取續(xù)濾液即得到對照品溶液。

2.2.3 顯色條件 本實(shí)驗(yàn)檢測三叉苦提取液中總黃酮含量主要采用三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（AlCl3-HAc-NaAc）顯色法[7]。精密移取1.0 ml供試品溶液，置入10 ml量瓶，分別加入0.1 mol/L AlCl3溶液和NaAc-HAc（pH 5.2）溶液1 ml，純水定容后顯色15 min，于415 nm波長處檢測吸光值。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依次移取蘆丁對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml，轉(zhuǎn)移至20 ml量瓶，按2.1.3項(xiàng)下方法顯色測定。回歸方程為y=1.2861x+0.0043，R2=0.9992，表明對照品溶液在4.00～24.00 μg/ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱藥材粉末6份，按2.2.1項(xiàng)下進(jìn)行制備，取1 ml，置入10 ml量瓶，按2.1.3項(xiàng)下顯色后測定各溶液中的吸光度。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的總黃酮溶液1 ml，置入10 ml量瓶，顯色后平行測定6次吸光度。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的總黃酮溶液1 ml置入10 ml量瓶，顯色后，于0，10，20，30，40，50，60，90，120，150，180 min測定吸光度。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取6份總黃酮含量已知的供試品溶液1 ml，加入蘆丁對照品溶液適量，顯色后測定吸光度。

2.3 三叉苦總黃酮的單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 按2.1.1項(xiàng)下制備方法，固定料液比為50:1、提取時(shí)間30 min，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)為50 %，60 %，70 %，80 %，95 %條件下的含量。

2.3.2 料液比 按供試品溶液制備方法，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70 %，提取時(shí)間30 min，考查料液比為10，25，50，75，100 ml/g條件下的含量。

2.3.3 提取時(shí)間 按供試品溶液制備方法，固定液料比為50 ml/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70 %，考查提取時(shí)間為15，30，60，90，120 min條件下的含量。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法

使用Design Expert 12.0軟件基于單因素考察的結(jié)果，以表1所列出條件為考察范圍，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素五水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)表

2.5 體外抗氧化活性測定

2.5.1 三叉苦總黃酮對DPPH的清除能力 將三叉苦提取液旋蒸成濃縮液（1 g/ml）后用真空冷凍干燥機(jī)制成凍干粉，加90 %乙醇配成濃度為50，100，250，500，750，1000 μg/ml樣品溶液，分別加入3.6 ml DPPH（0.2 mmol/L）溶液，混勻后避光靜置30 min，于λ=517 nm波長處測定吸光度值[4]，按樣品操作方法平行操作3次。

DPPH自由基清除率（%）=(A0-Ai)/A0×100 %

式中：A0為DPPH溶液與溶劑混合液的吸光度值；Ai為DPPH溶液與供試品溶液反應(yīng)后的吸光度值。

2.5.2 三叉苦總黃酮對ABTS自由基的清除能力 將ABTS儲(chǔ)備液（7.4 mmol/L）與K2S2O8儲(chǔ)備液（2.6 mmol/L）等體積混勻后，避光、常溫靜置12 h，PBS稀釋成吸光值0.7±0.02，即為ABTS工作液。

將三叉苦提取液旋蒸成濃縮液（1 g/ml）后用真空冷凍干燥機(jī)制成凍干粉，加90 %乙醇配成濃度分別為50，100，250，500，750，1000 μg/ml樣品溶液，取0.8 ml ABTS工作液分別與0.2 ml不同濃度樣品溶液混勻，常溫避光靜置6 min，測定734 nm處的吸光值[9]，按樣品操作方法平行操作3次。

ABTS自由基清除率（%）=(A0-Ai)/A0×100 %

式中：A0為ABTS工作液與溶劑混合液的吸光度值；Ai為ABTS工作液與供試品溶液反應(yīng)后的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 總黃酮含量測定結(jié)果

加熱回流及超聲法提取結(jié)果比較表明，加熱回流提取的含量測定結(jié)果比超聲提取法高2.49 mg/g，為提高提取率，故選用加熱回流作為提取方式。

重復(fù)性試驗(yàn)中吸光度的RSD為1.7 %，表明該方法重復(fù)性良好；精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD為1.14 %，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中吸光度的RSD為1.72 %，表明總黃酮溶液在顯色后180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗(yàn)中吸光度的平均加樣回收率為103.64 %，RSD為1.63 %，表明該方法可用于總黃酮的含量測定。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物中總黃酮含量的影響見圖1。由圖1可見，在一定濃度范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)濃度的增加與三叉苦總黃酮含量成正比，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)70 %時(shí)，含量不再增加，此時(shí)含量最高為27.42 mg/g。濃度超過70 %后含量反而降低，可能與溶出雜質(zhì)有關(guān)。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70 %為最佳條件。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察

3.2.2 液料比的影響 液料比對提取物中總黃酮含量的影響見圖2。由圖2可見，在一定范圍內(nèi)，液料比與總黃酮含量成正比，當(dāng)液料比為75 ml/g時(shí)含量達(dá)到最高，超過之后不再增加。因此，液料比為75 ml/g時(shí)最佳。

3.2.3 回流提取時(shí)間的影響 回流提取時(shí)間對提取物中總黃酮含量的影響見圖3。由圖3可見，當(dāng)液料比為75 ml/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %時(shí)，對提取時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，30 min時(shí)總黃酮含量最高，30～120 min含量呈緩慢增加的趨勢，最終120 min和30 min含量相近。可能因?yàn)辄S酮類物質(zhì)在加熱前浸泡的30 min內(nèi)已經(jīng)大量溶出，使總黃酮提取較完全[10]。因此最佳回流時(shí)間確定為30 min。

圖3 提取時(shí)間考察

綜上，最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %，液料比75 ml/g，提取時(shí)間30 min，在該條件下三叉苦總黃酮的提取率較高且較為節(jié)約能源。

3.3 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果

基于表1的設(shè)計(jì)因素水平，結(jié)合單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，以總黃酮提取率（Y）為因變量，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）為自變量進(jìn)行三因素五水平試驗(yàn)。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到的回歸方程為Y=2.75+0.0883×A+0.0434×B+0.0439×C-0.0488×AB+0.0287×AC-0.0188×BC-0.0316×A2+0.0301×B2+0.0284×C2（R2=0.8648），擬合度良好，相關(guān)系數(shù)較高，方差分析中的模型P＜0.05，表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與此同時(shí)，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明失擬項(xiàng)不明顯。

響應(yīng)面曲線的彎曲程度與該因素對響應(yīng)值的影響成正比；曲線平滑則表明該因素影響不顯著[8]。圖4表明響應(yīng)面起伏坡度較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對三叉苦總黃酮含量測定的影響較大；圖6可見響應(yīng)面較為平緩，料液比和提取時(shí)間的交互作用較小。此結(jié)果與方差分析一致。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響值大于液料比，液料比的影響值大于提取時(shí)間。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對總黃酮含量的響應(yīng)面圖

圖6 料液比和提取時(shí)間對總黃酮含量的響應(yīng)面圖

3.4 最佳提取工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

在以下范圍內(nèi)預(yù)測最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50 %～95 %，液料比10～50 ml/g，提取時(shí)間10～30 min。通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90 %，液料比為10 ml/g，提取時(shí)間為30 min時(shí)為最佳組合因素。對上述條件進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)總黃酮提取率實(shí)測值2.99 %，與預(yù)測值3.25 %偏差較小，表明模型能較好預(yù)測三叉苦中黃酮得率，認(rèn)為該優(yōu)化工藝較穩(wěn)定可靠。

3.5 三叉苦總黃酮清除DPPH的能力

三叉苦總黃酮的DPPH自由基清除率見圖7。由圖7可見，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/ml時(shí)，三叉苦總黃酮的DPPH自由基清除率為47.11 %，三叉苦總黃酮清除DPPH的能力與質(zhì)量濃度成正比。維生素C的IC50值為109.5 μg/ml，清除率可達(dá)90 %，表明三叉苦提取物除DPPH自由基的能力弱于維生素。

圖7 三叉苦提取物對DPPH自由基清除率的影響

3.6 ABTS自由基清除能力測定

三叉苦醇提物的ABTS自由基清除率見圖8。由圖8可見，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/ml時(shí)，三叉苦醇提物的ABTS自由基清除率與維生素C相近，質(zhì)量濃度增加至250 μg/ml則與維C的清除能力相當(dāng)。結(jié)果表明，三叉苦提取物具有較好的清除ABTS自由基的作用。

圖8 三叉苦提取物對ABTS自由基清除率的影響

4 結(jié)論

目前對于三叉苦響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的研究報(bào)道較少，三叉苦的黃酮類成分具有較好的抗氧化作用，本實(shí)驗(yàn)通過比較加熱回流和超聲兩種提取方式，結(jié)果表明加熱回流的含測值比超聲高出2.49 mg/g，因此選擇加熱回流提取三叉苦總黃酮，并運(yùn)用響應(yīng)面法對提取工藝中常見的3個(gè)因素進(jìn)行考察并優(yōu)化，篩選出三叉苦總黃酮的最佳工藝。結(jié)果表明最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90 %，液料比10 ml/g，提取時(shí)間30 min。按照此條件下三叉苦總黃酮含測值為27.57 mg/g，即總黃酮得率為2.99 %，與預(yù)測值3.25 %差距較小，表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)建立的數(shù)學(xué)模型對實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果可擬合，表明該提取工藝有較強(qiáng)的可行性。

抗氧化活性相關(guān)測定試驗(yàn)表明，當(dāng)三叉苦總黃酮提取物濃度達(dá)到250 μg/ml時(shí)，對ABTS的清除能力與維C相當(dāng)，對DPPH的清除能力與濃度存在量效關(guān)系，表明其具有較好的抗氧化活性，可應(yīng)用于開發(fā)功能食品或藥品等。