霉變三七粉中病原菌的分離鑒定

和玉鳳，張關能**，劉恩芬，付玲凡，和春龍

(1.云南聯大科技產業有限責任公司，云南 昆明 650500；2.云南中煙再造煙葉有限責任公司，云南 昆明 650106)

三七(Panaxnotoginseng)，又名人參三七、田七、文州三七、參三七，味甘，微苦，無毒，是中國享譽海內外的傳統名貴中藥材，其根和葉都可以做藥，具有“散瘀止血、消腫定痛、益氣活血”等效果[1]。現代藥理藥效研究[2-5]發現，三七對心腦血管系統、代謝系統、血液系統、神經系統、免疫系統疾病防治都有顯著的療效，有享“參中之王”“金不換”“南國神草”等美譽。

三七的成分構成十分復雜，其中含有多糖、黃酮、三七皂苷、多種微量元素、多肽類化合物[6]等化學物質，這些成分是三七吸水性較強的主要因素。因此，在三七的生產、加工、包裝、運輸、存儲等過程中，即使已經加強注意，但三七還是容易出現發霉、變質等現象[7]。云南作為三七的主產區，全國95%以上的三七都來自云南。據行業協會統計，云南省在2015年，三七種植面積就達到6.72萬hm2(100.8萬畝)，三七交易收入高達103億元人民幣，三七的年產量為4.9萬噸[8]。隨著國家的技術支持，三七種植貯藏規模也越來越大，出現的霉變情況也隨著增多，造成的損失也越來越大。宋美芳等[9]從自然儲藏后霉變的三七中分離到擬青霉屬、青霉素和鐮刀菌屬真菌，其中淡紫擬青霉和桔青霉為優勢菌，同時分離到三七致病菌尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌。王炳艷等[10]采用發霉三七挑選出菌絲進行培養和純化，分離到了米曲霉舒展變種、塔賓曲霉、日本曲霉原變種、炭黑曲霉、粒落曲霉、寄生曲霉、聚多曲霉、毒曲霉、合陽曲霉、多育曲霉、溜曲霉、兩形頭曲霉、肇慶曲霉和黃曲霉柱頭變種等14種曲霉。

本研究從霉變的三七粉中分離出了赭綠青霉(P.ochrochloron)、橘青霉(P.citrinum)、黃曲霉(A.flavus)、拜賴青霉(Penicilliumbilaiae)、草酸青霉菌(P.oxalicum)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和土曲霉(A.terreus)等7種霉變真菌，并鑒定出了橘青霉和黃曲霉兩種，結果表明霉變三七中已經含有霉菌毒素，建議人們不要食用已霉變三七，也為三七存儲提供一些參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

三七粉：采購于文山三七國際交易市場。

PDA培養基：用天平稱取馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 20 g(液體培養基不加)，自然pH。配制的方法為：將土豆去皮后稱重，切成小塊或絲狀，保持沸騰狀態15～20 min，期間不斷攪拌，防止鍋底的淀粉沉淀煮糊，采用雙層紗布進行過濾，然后加入葡萄糖，用水定容至 1 L，進行分裝并封口，后于 121 ℃ 高溫滅菌鍋中滅菌 30 min。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株的分離和純化

用天平秤取 10 g 三七粉裝入 250 mL 錐形瓶，再用量筒量取 100 mL 無菌水加入錐形瓶，此時相當于稀釋了10倍，放入 28 ℃、160 r/min 的條件下振蕩 30 min，靜置 5 min，在超凈工作臺中取上清液梯度稀釋為100倍、 1000倍，分別取各濃度稀釋液 0.2 mL，加到直徑為 9 cm 的培養皿中，進行涂板。使用已滅菌的固體PDA培養基，加熱融化，待冷卻至 50 ℃ 左右加入氯霉素(使氯霉素質量濃度為 10 μg/mL)后倒板，放置 30 min 左右冷卻凝固后即可以涂板，每個梯度的涂4皿，同時用無菌水涂4個板作為對照，涂板完成后用封口膠封口，置于 28 ℃ 的培養箱中，黑暗培養 4 d。取出培養基，數清菌落數。用接種針挑選出含真菌單菌落的樣本，轉移到其他新的培養基上，得到單一真菌，如果得到的不是單菌落再重復上一步。

1.2.2 形態學鑒定

用接種針挑取出單一真菌，接種于PDA培養基上，觀察菌落形態相同的視為同一菌株，篩選到9個菌株，分別標記為37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6和37-7、37-8和37-9。

根據霉變菌落、分生孢子形態及分生孢子梗的觀察結果，參考《常見與常用真菌》[9]《真菌鑒定手冊》[10]進行霉變菌的形態鑒定。

1.2.3 真菌的rDNA-ITS分子鑒定

按真菌rDNA-ITS分子鑒定法提取DNA，通過參考曹永軍等[11]的步驟進行擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送到昆明擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析與系統發育樹構建

根據測序結果并在NCBI的GenBank數據庫中比對找出同源序列，利用分子進化遺傳分析軟件(MEGA5.1)通過鄰接法構建各菌株相關基因標記的系統發育樹，綜合形態鑒定結果，進一步鑒定個菌株所屬的種屬分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

分離后根據細菌、真菌和放線菌菌落形態的不同進行初步篩選，篩選結果見表1。

表1 初步分離菌落數

從結果看，分離時出現了大量的細菌菌落，經形態觀察，大致分為6種，其中5種表面干燥，應該為革蘭氏陽性菌；同時有一皿出現5個放線菌菌落，這些菌落在PDA培養基菌落致密，菌落呈放射狀，表明干燥，菌落為白色，5個菌落形態大致相同，可能是同一種放線菌。根據霉菌形態大致相同的并為1種，分離到9株真菌。

2.2 真菌形態鑒定

把2.1中分離到的9株真菌，按37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7、37-8和37-9標識，并觀察真菌菌落形態，如圖1所示。對曲霉和青霉的分生孢子和菌絲進行觀察，如圖2所示。

圖1 霉菌菌落形態(37-1到37-9)

圖2 曲霉和青霉分生孢子和菌絲

結合分子鑒定結果可知，37-1、37-4和37-7都可能是拜賴青霉；同時，通過菌株孢子的觀察，37-5、37-6、37-9分生孢子梗末端為具有頂囊，頂囊表面四周或上半部著生一層或兩層呈輻射狀排列的小梗，應該為曲霉。37-2、37-3和37-8等幾個菌株的分生孢子梗頂端多次分枝成掃帚狀、分枝頂端著生小梗，符合青霉分生孢子形態[12]。

2.3 真菌分子鑒定

2.3.1 擴增產物rDNA測序條

對擴增產物用測序儀進行分析測定，通過NCBI分子鑒定比對結果：37-1與Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度為100%；37-2與Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度為99.83%；37-3與Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度為100%；37-4與Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度為100%；37-5與Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度為100%；37-6與Aspergillusterreusisolate OAT相似度為100%；37-7與PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度為99.82%；37-8與PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度為100%；37-9與Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度為100%。

2.3.2 構建系統發育樹

因為菌株較多，本文選取一個青霉(37-1)，一個曲霉(37-5)構建系統發育樹。

2.4 結果分析

通過NCBI分子鑒定比對結果，用系統發育樹鑒別菌株親緣關系，再結合形態鑒定可得：37-1與Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度為100%，為拜賴青霉；37-2與Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度為99.83%，為草酸青霉菌；37-3與Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度為100%，為赭綠青霉；37-4與Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度為100%，為拜賴青霉；37-5與Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度為100%，為煙曲霉；37-6與Aspergillusterreusisolate OAT相似度為100%，為土曲霉；37-7與PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度為99.82%，為拜賴青霉；37-8與PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度為100%，為橘青霉；37-9與Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度為100%，為黃曲霉。

3 討論

在實驗過程中發現，分離時細菌菌落數遠遠多于真菌菌落數量，考慮其中一些菌落中，存在一些具有抑制真菌生長的細菌。為了驗證這個猜想，又進行了一系列實驗。

3.1 拮抗細菌的篩選

初步篩采用菌落對峙試驗，用接種針挑取黃曲霉接種于PDA平板中央， 3 cm直徑外用接種環接種6個菌株(Z-1到Z-6)菌液，28 ℃ 培養7 d， 觀察生長狀況及抗菌表型。結果Z-1到Z-4都有抑菌作用，Z-1效果最好，結果見圖3。另外，三個較差，所以淘汰掉效果不好和沒有效果的菌株，只留下Z-1。

圖3 Z-1對黃曲霉的抑制作用

3.2 Z-1的鑒定

因為Z-1效果很好，所以對該菌株進行了生理生化鑒定和分子鑒定。菌株的生理生化特征結果見表2。

表2 菌株Z-1的主要生理生化特征

生理生化鑒定參考，分子鑒定參考。NCBI對比結果顯示Z-1與Bacillusvelezensisstrain CD91相似度達到100%，結合生理生化鑒定結果，可以鑒定Z-1為絲狀芽孢桿菌(Bacillusvelezensi)。霉菌廣泛分布于自然界，不少霉菌都會產生對人畜有害的霉菌毒素。因此霉菌與霉菌毒素對食品的污染越來越受到人們的重視。中藥材受到真菌污染的情況很常見，各種藥材受到真菌污染程度不同，污染真菌種類也不同。國外，Wongwiwat Tassaneeyakul 檢測了泰國28種中藥產品，受到黃曲霉毒素污染中藥產品有18%[17]。M.Halt對62份藥用植物和11份藥茶用品進行檢測，赭曲霉毒素和黃曲霉毒素為主要污染毒素[18]。國內，陳微對18種中藥材表面真菌及真菌毒素污染研究發現12種優勢真菌中10種以可以產毒，產生的毒素包括黃曲霉毒素[19]。宋美芳等對云南草果表面真菌進行分離鑒定表明草果污染菌中的優勢菌為淡紫擬青霉和黃曲霉[20]。Z-1菌株對黃曲霉抑制效果極為顯著，具有極高的生防潛力。

4 結論

實驗從霉變三七粉中分離得到9個菌株，其中有3個曲霉和6個青霉，有3個青霉為同一種，即分離得到2屬7種霉菌，其中的桔青霉，煙曲霉和黃曲霉都會產生霉菌毒素。表明霉變的三七粉受到霉菌毒素污染的威脅。三七粉的價格相對較高，在日常生活中，往往會由于存貯不當或者存放時間太長等一些情況導致三七粉發生霉變現象，有些肉眼看到的霉變情況不太嚴重，直接丟棄比較浪費。三七粉具有藥用價值，僅考慮可能降低了藥效，但是往往忽略了霉變產生的霉菌毒素的攝入可能對身體帶來更大的危害，有些毒素含量達到一定的濃度，甚至可能致死。