外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發及幼苗生理特性的影響

宋建超， 楊 航， 景媛媛， 陳彥珠， 魚小軍

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

隨著農業和工業的不斷發展，污水、廢氣的排放導致生態環境污染加劇。農業生產過程中，人們單純的追求作物高產高質，不注重化肥、農藥以及灌溉方式等的合理使用，加之氣候變化，導致全球鹽漬化土壤面積不斷增加[1]。草地的不合理利用和過度放牧等也會加劇土壤的鹽漬化[2]。據聯合國教科文組織和聯合國糧食及農業組織的不完全統計，世界范圍內鹽堿地面積約為9.54億hm2[3]。中國現有鹽漬化土壤面積約為3 693.3萬hm2，主要分布在我國東北，華北、西北和濱海地區[3]，嚴重阻礙了農業生產和發展[4]。滲透脅迫、離子毒害和營養元素失調是鹽脅迫對植物造成的主要傷害，嚴重抑制了植物的生長發育[5-8]。同時鹽脅迫還使植物的光合作用和呼吸作用受阻，影響植物的吸水性，阻礙植物根系對必需營養元素的汲取，最終導致作物減產[9-10]。土壤鹽漬化已然成為威脅農業以及生態環境的世界性問題。

垂穗披堿草(Elymusnutans)為禾本科披堿草屬多年生叢生植物，具有抗旱、耐堿、營養品質好、適口性好、耐放牧等特性[11-12]，是青藏高原優良的牧草品種之一[13-14]。垂穗披堿草憑借較強的繁殖能力、對臨時生境的高度適應性，在退化草地的改良和人工草地的建設中扮演著重要角色，是高寒地區草地恢復、生態修復和建植人工草地的首選草種[15]。但是，土壤鹽漬化抑制了垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長，導致幼苗生長緩慢、死亡[16]，從而阻礙了退化草地的修復和人工草地的建植。

目前植物生長調節劑被廣泛應用于緩解植物對逆境的抗性研究中[17]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是普遍存在于生物體內的一類四碳非蛋白質氨基酸[18]，是植物細胞自由氨基酸庫中的重要組分，調控植物體內碳、氮兩大代謝途徑，可通過調節碳氮平衡和胞質pH、促進氨基酸和碳水化合物代謝、誘導激素合成(乙烯)等，參與植物生長發育調控，提高植物的適應性和抵御非生物脅迫、病蟲害的能力[19]。GABA在植物體內作為一種信號分子，與植物激素相互協調發揮作用，在逆境脅迫下GABA能夠發揮滲透調節、抗氧化保護以及清除活性氧的功能[20]。研究表明，植物在適宜生長條件下體內GABA含量低，當受到外界脅迫時，植物體內GABA含量會迅速增加，表明GABA可能在抵御非生物脅迫中發揮著重要作用[21]。已有報道指出，通過GABA浸種能夠促進小麥(Triticumaestivum)幼苗的生長，并且在0.5 mmol·L-1GABA處理下小麥發芽率和鮮重明顯提高，可以減輕鹽脅迫對小麥幼苗造成的傷害[22]。田小磊等[23]的研究表明，鹽脅迫嚴重抑制了玉米(Zeamays)種子的萌發，添加外源GABA可顯著提高玉米種子的發芽率，并且能夠提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性，來緩解鹽脅迫對玉米幼苗的傷害。

然而，不同植物對外源GABA的響應存在差異，并且有關其調節垂穗披堿草種子萌發過程中耐鹽性和耐鹽機制的研究較少。因此，本試驗研究100 mmol·L-1NaCl脅迫下，施加不同濃度的外源GABA對垂穗披堿草種子萌發和幼苗生理特性的影響，旨在探究外源GABA提高垂穗披堿草耐鹽性的生理機制，以期為垂穗披堿草抗逆性研究奠定理論基礎，并為其耐鹽性栽培管理以及退化草地修復提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子為垂穗披堿草種子，產地位于青海省，于2020年9月下旬收獲，帶回實驗室并保存于4℃低溫種子庫中，初始發芽率約為90%。本試驗于2021年7月在甘肅農業大學草業學院實驗室進行。

GABA購買上海麥克林生化科技有限公司，純度≥99%，可配制成含10 mmol·L-1GABA的100 mmol·L-1NaCl母液備用，使用前稀釋為相應濃度的處理液。

1.2 材料處理

從供試垂穗披堿草種子中，挑選大小均一且無霉變和破損的種子，用75%的乙醇溶液消毒1 min，用蒸餾水反復沖洗7～9次，將殘余乙醇沖洗干凈，最后用濾紙吸干種子表面水分備用。

1.3 試驗設計

本試驗采用100 mmol·L-1NaCl溶液作為鹽脅迫處理，此時的脅迫程度為中度鹽脅迫[16]。挑選經消毒處理過的垂穗披堿草種子50粒，置于雙層濾紙的9 cm一次性培養皿中，加入配置好的含GABA的NaCl溶液。本研究共設置8個處理分別為(表1)：CK1(對照(蒸餾水))，CK2(100 mmol·L-1NaCl溶液，G1(100 mmol·L-1NaCl + 0.05 mmol·L-1GABA)，G2(100 mmol·L-1NaCl+0.10 mmol·L-1GABA)，G3(100 mmol·L-1NaCl+0.25 mmol·L-1GABA)，G4(100 mmol·L-1NaCl+0.50 mmol·L-1GABA)，G5(100 mmol·L-1NaCl+1.00 mmol·L-1GABA)，G6(100 mmol·L-1NaCl+2.00 mmol·L-1GABA)，每個處理設3次重復。將培養皿置于光照培養箱內進行發芽試驗，萌發條件為光照14 h/25℃，黑暗10 h/15℃，光照強度為6 000 lx[24]。在固定時間進行稱重補充散失的水分以保持鹽溶液濃度，每天觀察并記錄當日發芽數，胚芽長度達到種子長度1/2為發芽標準，并連續記錄12 d。試驗第5 d計算發芽勢，發芽試驗結束后統計發芽指標以及幼苗根長和苗長，并且進行幼苗生理指標的測定。

表1 試驗各處理溶液濃度Table 1 The solution concentration of each treatment in the experiment

1.4 測定指標與方法

1.4.1發芽指標的測定 種子萌發相關指標發芽勢、發芽率、發芽指數及活力指數等測定和計算公式如下[25]：

發芽勢(Germinating energy,GE，%)=(發芽試驗前5 d的正常發芽種子數/供試種子數)×100%

發芽率(Germination percenage，G，%)=(發芽終期12 d內的正常發芽種子數/供試種子數)×100%

發芽指數(Germination inde,GI)=∑(Gt/Dt)

式中Gt為第t天相應的發芽數，Dt為相應的發芽天數。

活力指數(Vigor index，VI)=GI×S

式中S為幼苗平均長度，GI為發芽指數。

1.4.2生長指標的測定 苗長和根長：發芽試驗結束后，在各處理培養皿中隨機選取10株幼苗，用直尺(0.1 cm)測量幼苗苗長和根長。

1.4.3幼苗生理指標的測定 可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定，脯氨酸(Proline,Pro)含量采用磺基水楊酸法測定，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[26]。POD活性采用愈創木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定，SOD活性采用氮藍四唑(Nitro-blue tetrazolium，NBT)法測定[27]。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2019處理數據和制圖，用SPSS 26.0軟件進行單因素方差(ANOVA)分析，并用Duncan法進行多重比較，差異顯著性均采用P<0.05表示，各指標數據均為3個重復的“平均值±標準誤”表示。

利用主成分分析將外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長的相關指標降維,篩選出耐鹽性綜合指標，并計算出綜合指標權重，最后采用隸屬函數進行外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長緩解效應的綜合評價。以上參考王苗苗等[28]的方法，計算方法如下：

(1)各處理綜合指標隸屬函數值：

(1)

Xj表示第j個綜合指標；Xjmin表示第j個綜合指標最小值；Xjmax表示第j個綜合指標最大值。

(2)各處理綜合指標權重：

(2)

wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權重；Pj表示第j個綜合指標的貢獻率。

(3)各處理緩解效應綜合評價：

(3)

D值為外源GABA在NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長的緩解效應綜合評價值，其值越高說明在該濃度處理下外源GABA對NaCl脅迫的緩解效應越好。

2 結果與分析

2.1 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發及幼苗生長的影響

與CK1(蒸餾水)相比，NaCl脅迫(100 mmol·L-1)顯著抑制了垂穗披堿草的萌發,降低了其苗長和根長，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA能夠明顯促進垂穗披堿草種子的萌發和生長(表2)。NaCl脅迫(CK2)處理下，垂穗披堿草種子的萌發指標均顯著低于蒸餾水對照(CK1)處理(P<0.05)。NaCl脅迫處理下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA可提高垂穗披堿草種子的發芽勢和發芽率，且不同濃度處理間存在差異。與CK2相比，G4(0.5 mmol·L-1)處理下垂穗披堿草的發芽勢和發芽率分別提高了130.43%和26.87%。在NaCl脅迫處理下，添加外源GABA顯著提高了垂穗披堿草種子的發芽指數和活力指數(P<0.05)，且不同濃度處理間存在差異。與CK2相比，在G4(0.5 mmol·L-1)處理下垂穗披堿草的發芽指數和活力指數分別提高了82.11%和224.00%。

鹽脅迫顯著抑制了垂穗披堿草幼苗的生長(表2)，與CK1相比，其苗長和根長顯著降低(P<0.05)。NaCl脅迫處理下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA顯著提高了垂穗披堿草幼苗的苗長和根長(P<0.05)，且不同濃度處理之間存在差異，與CK2相比，G4處理下垂穗披堿草的苗長和根長分別提高了77.98%和107.34%。

表2 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發及幼苗生長的影響Table 2 Effects of exogenous GABA on seed germination and seedling growth of Elymus nutans under NaCl stress

2.2 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發過程中滲透調節物質和MDA含量的影響

與CK1(蒸餾水)相比，100 mmol·L-1鹽脅迫顯著提高了垂穗披堿草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量(P<0.05)(圖1)。在鹽脅迫下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA提高了垂穗披堿草幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量(P<0.05)，可溶性糖含量則呈現“先降后升”的變化趨勢。并且不同濃度GABA處理間存在差異，其中可溶性糖含量在G5和G6處理下最高，高溶性蛋白含量在G4和G5處理下最高，脯氨酸含量在G5處理下最高，分別較CK2處理提高了16.71%和22.48%，75.54%和61.58%，36.35%。

如圖1D所示，與CK1處理相比，100 mmol·L-1鹽脅迫顯著提高了垂穗披堿草幼苗丙二醛含量(P<0.05)。在鹽脅迫下，外源添加0.05～2 mmol·L-1GABA能夠顯著降低丙二醛含量，并且不同濃度處理均與CK2差異顯著(P<0.05)。其中，在G4和G5處理下丙二醛降低效果最好，分別較CK2處理降低了53.72%和49.41%。

圖1 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草幼苗可溶性糖(A)、可溶性蛋白(B)、脯氨酸(C)和MDA(D)含量的影響Fig.1 Effect of exogenous GABA on the contents of soluble sugar (A),soluble protein (B),proline (C) and MDA (D) in Elymus nutans seedlings under NaCl stress注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)，下圖同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between each treatment at the 0.05 level,the same as below

2.3 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草幼苗體內抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，與CK1(蒸餾水)相比，100 mmol·L-1鹽脅迫和鹽脅迫下不同濃度的GABA處理顯著增加了幼苗POD，CAT和SOD活性(P<0.05)。鹽脅迫下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA能顯著提高垂穗披堿草幼苗抗氧化酶POD，CAT和SOD活性(P<0.05)，且在不同濃度GABA處理間存在差異，其中G5處理對POD活性的促進效果最佳，G4處理對CAT和SOD活性的促進效果最佳，三種酶活性分別較CK2處理提高了97.27%，56.19%和31.91%。

圖2 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草幼苗SOD(A)，CAT(B)，POD(C)活性的影響Fig.2 Effects of exogenous GABA on SOD (A),CAT (B) and POD (C) activities of Elymus nutans seedlings under NaCl stress

2.4 綜合評價

采用主成分分析法，將NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發參數、幼苗生長和幼苗滲透調節物質、抗氧化系統等指標分為了2個主成分(表2)。其中第1主成分各指標系數較大的是發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、苗長和根長，特征值為6.936，貢獻率為53.351%。第2主成分各指標系數較大的是可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及POD，CAT，SOD活性，特征值為5.392，貢獻率為41.473%，二者累計貢獻率達到了94.825%。

利用隸屬函數法對外源GABA對NaCl脅迫緩解效應進行綜合評價(表3)得出，添加外源GABA在G2至G6處理對NaCl脅迫的緩解效果明顯。在G4(0.5 mmol·L-1)處理下，外源GABA對垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長緩解NaCl脅迫的效果最佳。綜合評價結果為：G4>G5>G3>G6>G2>CK1>G1>CK2。

表3 各綜合指標系數及貢獻率Table 3 Coefficient and contribution rate of each comprehensive index

續表3

表4 不同處理各綜合指標值、權重、隸屬函數值、D值及鹽脅迫緩解效應評價Table 4 The comprehensive index values,index weight,membership function value,D values and mitigation effect evaluation of salt stress under different treatments

3 討論

鹽脅迫是影響植物種子萌發和幼苗生長的主要非生物脅迫。種子萌發是植物開始個體發育第一階段的復雜生理過程，是影響植物生命周期的關鍵環節[17]。種子的發芽率、發芽勢、發芽指數反映了種子的發芽速率，活力指數則說明了種子能否迅速發芽和生長的整齊程度[29]。本研究表明，在100 mmol·L-1的NaCl脅迫處理下顯著抑制了垂穗披堿草種子的萌發和生長。原因可能是100 mmol·L-1NaCl處理損壞了細胞質膜，增大了細胞膜通透性，導致細胞內液外流，打破胞內離子平衡，影響了垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長，這與前人的研究結果一致[17]。有研究表明，種子萌發過程中氨基酸代謝發生改變，激活包括谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)等多種關鍵酶，參與種子的萌發過程，而GABA作為谷氨酸脫羧酶的產物，在植物種子萌發期間發揮著重要作用[18]。并且在種子萌發期間，GAD催化谷氨酸脫去羧基生成的GABA，經GABA-T催化GABA生成琥珀酸半醛(Succinic semialdehyde，SSA)，隨后被催化生成琥珀酸，參與三羧酸(Tricarboxylic-acid，TCA)循環或直接進入呼吸鏈氧化，為抵抗脅迫反應提供能量[30-32]。本研究結果表明，在NaCl脅迫下，添加外源GABA可顯著促進垂穗披堿草種子萌發和幼苗的生長，且在0.5 mmol·L-1GABA處理下的效果最優。趙嫚等[19]研究發現，外源施用0.5～2.0 μmol·L-1GABA促進了鹽脅迫下金花菜(Medicagopolymorpha)種子萌發和幼苗的生長，這與本研究結果類似。研究表明，添加外源GABA增加了玉米幼苗在高鹽脅迫下內源GABA的濃度，使幼苗的耐鹽性增強[33]。也有報道指出，外源GABA可誘導植物體內乙烯的合成，而乙烯對促進種子萌發具有重要作用[34]。說明，施用外源GABA可提高植物內源GABA含量，誘導乙烯的合成，并為植物抵抗外界脅迫提供能量，從而促進種子的萌發和幼苗的生長發育。

滲透調節物質是植物體內應對逆境脅迫誘導積累的重要信號物質，在植物種子萌發的過程中起到關鍵作用[35]。在鹽脅迫下，植物體內產生滲透脅迫，不得不積累更多的滲透調節物質來緩解鹽脅迫引發的滲透脅迫。本研究結果表明，在100 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，垂穗披堿草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量較CK1(蒸餾水)顯著增加，來調節滲透平衡，從而緩解鹽脅迫。在鹽脅迫下，添加外源GABA顯著增加了垂穗披堿草幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量，可溶性糖含量呈“先降后升”趨勢。研究表明，施用外源GABA增加了鹽脅迫下甜高粱(Sorghumdochna)幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量，緩解了其所受的鹽脅迫，這與本研究結果類似[36]。王驍[37]的研究結果表明，在高濃度鹽脅迫下添加外源GABA后西伯利亞白刺(Nitrariasibirica)幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量呈“先升后降”趨勢。以上研究均說明，鹽脅迫下植物通過提高自身滲透調節物質來緩解鹽脅迫，添加外源GABA可促使植物幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調節物質積累增多，一方面為種子萌發不斷提供能量和營養物質，另一方面有助于有害物質的中和，提高植物的耐鹽性。

4 結論

NaCl脅迫抑制了垂穗披堿草種子的萌發和幼苗的生長，外源GABA處理可促進NaCl脅迫下垂穗披堿草種子的萌發和幼苗的生長。在NaCl(100 mmol·L-1)脅迫下，外源施用0.05～2.00 mmol·L-1GABA促進了垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長，并且增加了萌發過程中幼苗滲透調節物質含量，降低MDA含量，提高抗氧化酶活性，改善了垂穗披堿草種子萌發過程中的耐鹽性。利用隸屬函數綜合評價得出：0.5 mmol·L-1外源GABA處理對促進NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發和幼苗生長效果最佳。建議可通過包衣或浸種0.5 mmol·L-1GABA提高NaCl脅迫下垂穗披堿草種子的出苗率，并促進幼苗生長。