食管鱗癌原位模型小鼠腸道菌群分析

張玉雙，于富洋，吳忠冰，王一然，李晶，*

本研究背景：

已有研究表明腸道菌群與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關(guān)，尤其在結(jié)直腸癌、肝癌方面的研究較多。食管癌是我國(guó)的高發(fā)腫瘤，其發(fā)病率與死亡率均為世界平均水平的2 倍以上。我國(guó)以食管鱗癌為主，早期行根治術(shù)后預(yù)后較好，但相當(dāng)多的患者就診時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此尋找簡(jiǎn)便易取材的檢驗(yàn)方法，提高食管癌早期診斷率并給予干預(yù)措施十分重要。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

（1）高比例成功制備了食管鱗癌原位模型小鼠，模擬了食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，為同類(lèi)研究提供了基礎(chǔ)。（2）選擇飼養(yǎng)環(huán)境一致的小鼠作為研究對(duì)象，可以減少因?yàn)轱嬍场h(huán)境等因素對(duì)菌群研究結(jié)果造成的誤差。（3）通過(guò)初步對(duì)食管癌差異菌屬的篩選，為下一步探討機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

最新的《全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示，2020 年全球食管癌新發(fā)病例數(shù)為60.4 萬(wàn)例，死亡病例數(shù)為54.4 萬(wàn)例，分別占全球癌癥新發(fā)、死亡總病例數(shù)的3.1%、5.5%［1］。食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)地域差異較大，我國(guó)是食管癌發(fā)病高風(fēng)險(xiǎn)國(guó)家，據(jù)統(tǒng)計(jì)2020 年我國(guó)新發(fā)食管癌病例數(shù)為32.4 萬(wàn)例，死亡病例數(shù)為30.1 萬(wàn)例，分別占全球食管癌新發(fā)、死亡總病例數(shù)的53.7%、55.3%［2］。我國(guó)食管癌患者病理類(lèi)型以鱗癌為主，早期行根治術(shù)后預(yù)后較好，但由于相當(dāng)多的食管癌患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此提高食管癌早期診斷率仍具有十分重要的意義。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，腸道微生態(tài)研究已成為目前腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。有研究證實(shí)腸道菌群在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，食管鱗癌患者口腔、癌組織及癌旁正常組織中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變并與食管癌的發(fā)生有關(guān)［3-4］。因腸道菌群的影響因素較多，本研究特選取飼養(yǎng)環(huán)境可控的食管鱗癌原位模型小鼠，以觀察與食管鱗癌相關(guān)的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化、篩選出特異性改變的腸道菌屬，為食管鱗癌的早期篩查提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)雌性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠20 只〔合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006〕，體質(zhì)量14～17 g，鼠齡6 周。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后將所有小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（DZ 組）和模型組（MX 組），每組10 只。所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵照河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心指南執(zhí)行，遵守動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物倫理原則及相關(guān)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020 年8 月至2021 年5 月。

1.2 干預(yù)方法 DZ 組小鼠常規(guī)喂養(yǎng)32 周，全程給予普通飲用水；MX 組小鼠按照造模方法常規(guī)喂養(yǎng)并給予含0.1 mg/ml 的誘癌劑4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）飲用水喂養(yǎng)16 周，之后給予普通飲用水喂養(yǎng)至32 周。4NQO 飲用水制備方法：將誘癌劑4NQO（購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，型號(hào)：N8141）溶解于1，2 丙二醇，配制成濃度為2%的母液并保存于-20 ℃冰箱，使用時(shí)按照0.1 mg/ml 濃度比例混入飲用水中。

1.3 糞便的無(wú)菌收集與處理 喂養(yǎng)32 周后收集兩組小鼠糞便：在籠具里面放入干凈的濾紙后將小鼠依次放入，每籠1 只；用鑷子輕輕刺激小鼠下腹和肛門(mén)，待小鼠排便后立即用凍存管進(jìn)行收集；將凍存管做好標(biāo)記后放入液氮中，5 min 后再將凍存管放入-80 ℃冰箱中保存。最終共收集到20 個(gè)糞便標(biāo)本，每組10 個(gè)。上述操作均在滅菌超凈臺(tái)上進(jìn)行，且所用材料均采用紫外線滅菌處理。

1.4 糞便樣本檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB 法）提取糞便標(biāo)本基因組DNA，應(yīng)用16SV34 區(qū)域引物序列341F：CCTAYGGGRBGCASCAG、806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增；將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，并根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后采用膠回收試劑盒回收目的條帶以純化產(chǎn)物；最后使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample PreParation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，經(jīng)Qubit、Q-PCR 定量檢測(cè)構(gòu)建文庫(kù)合格后使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

通過(guò)對(duì)測(cè)序序列（Reads）進(jìn)行拼接、質(zhì)控和過(guò)濾，以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為基于序列間相似度的分類(lèi)操作單元（operational taxonomic units，OTU），然后參照Silva138 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的OTU 序列進(jìn)行物種注釋，并根據(jù)物種注釋情況進(jìn)一步分析Alpha 多樣性、Beta 多樣性、物種豐度。

Alpha 多樣性分析包括：（1）稀釋曲線：是描述樣本多樣性的曲線，能夠直接反映樣本相關(guān)測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。（2）Shannon 指數(shù)：為菌群物種Alpha 多樣性分析常用的指數(shù)，反映不同樣本間物種多樣性和均一性的差別，Shannon 指數(shù)越大說(shuō)明菌群多樣性越高。

Beta 多樣性分析：是對(duì)兩組樣品間的菌群構(gòu)成情況進(jìn)行比較分析。主坐標(biāo)分析（PCoA）是常用的Beta多樣性分析方法，其基于Unweighted Unifrac 距離來(lái)進(jìn)行分析，樣本間距離越遠(yuǎn)代表樣本間多樣性差異越大。

物種豐度分析采用T-test 檢驗(yàn)和LEfSe 分析，其中LEfSe 分析是一種軟件分析，其能夠找到組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物。

1.5 食管組織蘇木素-伊紅（HE）染色 完成糞便收集后處死兩組小鼠，剝?nèi)∑涫彻芙M織并采用4%多聚甲醛溶液固定，之后進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE 染色，觀察兩組小鼠食管組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，先進(jìn)行方差齊性分析，之后進(jìn)行T-test 檢驗(yàn)。Anosim 相似性分析用于檢驗(yàn)組間差異是否大于組內(nèi)，判斷實(shí)驗(yàn)分組是否存在意義。基于兩兩樣本間的距離值排序獲得的秩（組間的為Between，組內(nèi)的為Within），這樣任一兩兩樣本的比較可以獲得3 個(gè)分類(lèi)的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行箱線圖的展示（若兩個(gè)箱的凹槽互不重疊，則表明兩樣本的中位數(shù)有顯著差異）。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管組織病理改變 兩組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)死亡，MX 組小鼠均造模成功。DZ 組小鼠食管組織正常，MX 組小鼠食管組織可見(jiàn)鱗狀上皮增殖、癌巢形成且癌巢內(nèi)可見(jiàn)角化珠（圖1）。

圖1 兩組小鼠食管組織HE 染色結(jié)果（×200）Figure 1 HE staining results of esophagus tissues two groups of mice

2.2 腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估與OTU 分析 對(duì)兩組小鼠共20 例糞便標(biāo)本進(jìn)行16Sr DNA 基因測(cè)序，對(duì)檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)，平均每樣品測(cè)得86 110 條tags，經(jīng)過(guò)質(zhì)控平均得到83 261條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)54 489，質(zhì)控有效率達(dá)63.16%。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析共得到2 314 個(gè)OTU，再用OTU 序列進(jìn)行物種注釋。結(jié)果共有862 個(gè)OTU 注釋到物種屬水平。

基于OTU 的Venn 圖中，2 種不同顏色的圓對(duì)應(yīng)兩組小鼠糞便所含的菌群，重疊部分則為兩組共同含有的菌群，DZ 組較MX 組腸道菌群物種豐富程度明顯增加，兩組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，見(jiàn)圖2。同時(shí)選擇DZ 組與MX 組在門(mén)水平上豐度排名前10 的物種，繪制物種相對(duì)豐度柱狀圖（圖3），由圖可見(jiàn)，在門(mén)水平上兩組小鼠樣本部分物種豐度存在明顯差異，MX 組與DZ組相比，擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）及厚壁菌門(mén)（Firmicutes）比例升高，而疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）及變形菌門(mén)（Proteobacteria）比例降低。

圖2 兩組小鼠腸道菌群Venn 圖Figure 2 Venn diagram of intestinal flora between two groups of mice

圖3 兩組小鼠腸道菌群門(mén)水平物種相對(duì)豐度柱狀圖Figure 3 Relative abundance of species at phylum level intestinal flora of mice between two groups

2.3 兩組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析

2.3.1 兩組小鼠腸道菌群物種多樣性曲線 兩組小鼠菌群稀釋曲線均趨于平坦，則說(shuō)明目前樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，即使增加數(shù)據(jù)量也只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種，見(jiàn)圖4。

圖4 兩組小鼠菌群物種稀釋曲線Figure 4 Rarefaction curve of intestinal flora between two groups of mice

2.3.2 兩組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)組間差異分析 MX 組腸道菌群Shannon 指數(shù)低于DZ 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠腸道菌群Shannon 指數(shù)比較（±s）Table 1 Shannon Diversity Index analysis of intestinal flora between two groups of mice

表1 兩組小鼠腸道菌群Shannon 指數(shù)比較（±s）Table 1 Shannon Diversity Index analysis of intestinal flora between two groups of mice

注：DZ 組=對(duì)照組，MX 組=模型組

組別 只數(shù) Shannon 指數(shù)DZ 組 10 5.807±0.461 MX 組 10 4.549±1.450 t 值 2.614 P 值 0.024

2.4 兩組小鼠腸道菌群Beta 多樣性指數(shù)組間差異分析 PCoA 圖顯示，MX 組與DZ 組樣本基本上分別聚集在不同的象限，相距較遠(yuǎn)，樣本間多樣性差異較大（t=22.444，P=0.004），見(jiàn)圖5。

圖5 兩組小鼠腸道菌群Beta 多樣性PCoA 圖Figure 5 PCoA diagram of Beta diversity in intestinal flora between two groups of mice

2.5 兩組小鼠腸道菌群組間差異物種分析

2.5.1 兩組小鼠腸道菌群組間與組內(nèi)差異性分析Anosim 相似性分析結(jié)果顯示，兩組小鼠腸道菌群差異組間大于組內(nèi)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=0.476，P=0.001），見(jiàn)圖6。

圖6 兩組小鼠腸道菌群Anosim 組間差異分析Figure 6 Analysis of similarities （ANOSIM） of intestinal flora between two groups of mice

2.5.2 腸道菌群差異物種分析 在門(mén)水平，MX 組未明確細(xì)菌（Unidentified_ Bacteria）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、易感微生物（Elusimicrobia）、彎曲桿菌（Campilobacterota）豐度高于DZ 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 兩組小鼠腸道菌群門(mén)水平差異分析Figure 7 Differential species analysis of intestinal flora at the phylum level between two groups of mice

在屬水平，共有27 類(lèi)菌的豐度在兩組小鼠腸道菌群內(nèi)有差異（P 均<0.05）。豐度較高的前10 位腸道菌群：MX 組普雷沃菌科_UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、擬桿菌屬（Bacteroides）、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、 瘤 胃 球 菌 屬（Ruminococcus）、普雷沃菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、普雷沃菌屬（Prevotella）、大腸埃希菌（Colidextribacter）、毛螺菌科_UCG-006（Lachnospiraceae_UCG-006）豐度高于DZ 組，羅姆布茨菌（Romboutsia）、土桿菌屬（Turicibacter）豐度低于DZ 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 兩組小鼠腸道菌群屬水平差異分析Figure 8 Differential species analysis of intestinal flora at the genus level between two groups of mice

2.5.3 兩組小鼠腸道菌群LEfSe 分析 LEfSe 分析結(jié)果顯示，兩組共有21 種腸道菌群豐度有差異，其中梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、毛螺菌目（Lachnospirales）、Prevotellaceae_UCG-003、腸桿菌目（Enterobacterales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、大腸埃希菌種（Escherichia_coli）、 顫 螺 旋 菌 目（Oscillospirales）、 擬 桿 菌 科（Bacteroidaceae）、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）豐度在MX 組升高，另外Peptostreptococcales_Tissierellales、Romboutsia_ilealis、Romboutsia、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、丹 毒 絲 菌 科（Erysipelotrichaceae）、 丹 毒 絲 菌 目（Erysipelotrichales） 豐 度 在DZ 組 升 高（P<0.05）。在 屬 水 平 上，Prevotellaceae_UCG-003、Escherichia-Shigella、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group在MX 組 豐 度 增 高；Romboutsia 豐 度 在DZ 組 增 高（P<0.05），見(jiàn)圖9。

圖9 兩組小鼠腸道菌群LEfSe 分析柱狀圖Figure 9 Histogram of LEfSe analysis of intestinal flora between two groups of mice

3 討論

腸道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其擁有一個(gè)密集而多樣的微生物群落，稱之為腸道菌群，該菌群與宿主共同進(jìn)化以建立相互關(guān)系［5］。腸道菌群對(duì)宿主健康的主要作用表現(xiàn)在分解不可消化的碳水化合物［6］、合成維生素［7］、調(diào)節(jié)宿主防御［8］及調(diào)控腫瘤［9］，尤其在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。已有研究表明腸道菌群與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療效果密切相關(guān)，如結(jié)直腸癌［10-11］、肺癌［12］、胃癌［13］、肝癌［14］、黑色素瘤［15-16］等。目前有關(guān)腸道菌群在結(jié)直腸癌方面的研究較多，已發(fā)現(xiàn)部分特異性差異菌群，并進(jìn)行了深入的機(jī)制研究，如研究發(fā)現(xiàn)Colidextribacter 通過(guò)增加癌基因bcl-2 和bcl-xl 的表達(dá)，抑制結(jié)腸細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的形成［17］。產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌可產(chǎn)生脆弱擬桿菌毒素，與結(jié)腸上皮細(xì)胞相互作用，激活調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞并降低白介素（IL）-2 水平，隨著IL-2 水平的下降，輔助性T 淋巴細(xì)胞（Th17）的產(chǎn)生導(dǎo)致IL-17 水平升高，促進(jìn)癌細(xì)胞存活和增殖［18］。雙歧桿菌能增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞功能，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中CD8+T 細(xì)胞的啟動(dòng)和聚集介導(dǎo)效應(yīng)，從而增加程序性死亡受體-配體1（PD-L1）特異性抗體治療效果，抑制結(jié)腸癌的發(fā)展［19］。

關(guān)于腸道菌群和食管鱗癌相關(guān)性的研究較少，目前文獻(xiàn)已報(bào)道的差異菌群多為從口腔取材，腸道菌群報(bào)道較少。位俊敏等［20］研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者口腔中卟啉菌屬表達(dá)升高。ZHAO 等［4］報(bào)道食管癌患者唾液菌群中顯著增加的菌群為Firmicutes、革蘭陰性菌門(mén)（Negativicutes）、硒單胞菌門(mén)（Selenomonadales）、Prevotellaceae、Prevotella 和韋榮菌科（Veillonellaceae），而Proteobacteria、β-變形桿菌門(mén)（Betaproteobacteria）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）和奈瑟菌屬（Neisseria）則顯著減少。而DENG 等［21］研究發(fā)現(xiàn)在屬水平上，食管鱗癌患者糞便中鏈球菌（Streptococcus）、 雙 歧 桿 菌（Bifidobacterium）、Subdoligranulum、布勞特菌屬（Blautia）、Romboutsia、柯林斯菌屬（Collinsella）、Paeniclostridium、多爾菌屬（Dorea）和阿托波菌屬（Atopobium）豐度顯著增加，而毛螺菌屬（Lachnospira）、Bacteroides、Agathobacter、Lachnoclostridium、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、帕拉普菌屬（Paraprevotella）等菌屬豐度降低。可見(jiàn)上述研究報(bào)道的菌群存在很大差別，縱觀之前文獻(xiàn)報(bào)道的雖為同一類(lèi)型腫瘤患者，但腸道菌群中檢測(cè)出的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌群差別也較大，考慮腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境，容易受到患者飲食、情志、基礎(chǔ)疾病及藥物等的影響，故本研究選取4NQO 原位誘導(dǎo)食管癌模型小鼠糞便為檢測(cè)標(biāo)本，最大限度使飲食、環(huán)境等外界因素達(dá)到統(tǒng)一性，盡量避免誤差。

本研究結(jié)果顯示，MX 組與DZ 組相比腸道菌群的物種豐富度和多樣性明顯降低。兩組腸道菌群差異物種分析顯示，MX 組小鼠糞便中Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcus、Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella、Colidextribacter、Lachnospiraceae_UCG-006 豐度高于DZ組，Romboutsia、Turicibacter 豐度低于DZ 組。LEfSe 分析結(jié)果顯示，在屬水平上，Prevotellaceae_UCG-003、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、Bacteroides、Lachnospiraceae_ NK4A136_group 在MX 組 豐 度 明 顯增高，Romboutsia 豐度在DZ 組明顯降低。兩種檢驗(yàn)分析中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌屬為Prevotellaceae_UCG-003、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group 和Romboutsia，這4 種菌屬可能更具有生物標(biāo)志物意義。Bacteroidota 是腸道菌群的主要成分，其與Firmicutes約占腸道菌群的90% 以上，研究證實(shí)擬桿菌屬（Bacteroidetes）在結(jié)直腸癌患者糞便菌群中豐度明顯增高［22-23］，并有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬在食管鱗癌診斷中準(zhǔn)確率較高［21］；Prevotellaceae 在食管癌患者口腔菌群中及結(jié)直腸癌患者糞便菌群中豐度雖有明顯增高［4，24］，但本研究結(jié)果與其一致。但Lachnospiraceae_NK4A136_group 及Romboutsia 在結(jié)直腸癌及胃癌等腫瘤患者中豐度雖有明顯變化［21，25-26］，但本研究結(jié)果與之不同，因此還需進(jìn)一步研究檢測(cè)確定。

綜上所述，食管鱗癌原位模型小鼠腸道菌群物種多樣性降低，存在特異性差異菌屬，可為食管癌的診斷提供參考。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了MX 組較DZ 組小鼠腸道菌群顯著改變，但16SrDNA 為半定量檢測(cè)，故仍需宏基因組學(xué)或靶向微生物學(xué)的研究進(jìn)一步明確差異菌群，并進(jìn)行更加深入的機(jī)制研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，尋找食管鱗癌特異性的靶菌群。

作者貢獻(xiàn)：張玉雙、李晶進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；張玉雙、于富洋、吳忠冰、王一然進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；張玉雙、于富洋、吳忠冰整理數(shù)據(jù)；于富洋、吳忠冰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；張玉雙負(fù)責(zé)結(jié)果的分析與解釋、撰寫(xiě)與修訂論文；李晶對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。