基于全二維氣相色譜-飛行時間質譜對柴胡醋制前后揮發油成分的研究

★ 喬欣 陳文彬 馬亞男 葉耀輝（江西中醫藥大學 南昌 330004）

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）或 狹 葉 柴 胡（Bupleurum scorzonerifoliumWilld.）的干燥根，味辛、苦，性微寒；歸肝、膽、肺經；具有疏散退熱、舒肝解郁、升舉陽氣等作用，用于治療感冒發熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等［1］。柴胡為常用中藥，其炮制品有生柴胡、醋炙品、鱉血拌品、鱉血炙品、酒柴胡、蜜柴胡等［2］，各炮制品功效也不盡相同。一般認為生品柴胡升散作用較強，臨床多用于解表退熱；而醋炙柴胡可緩解升散之性，增加疏肝止痛作用；鱉血柴胡能填陰滋血，抑制其浮陽之性，增強清肝退熱的功效；酒炙柴胡能升舉脾陽、舒筋通絡；蜜炙柴胡能減緩藥性、矯正氣味，增強止咳潤肺功效。

揮發油是柴胡主要有效成分之一，現代研究表明柴胡揮發油不僅具有解熱、鎮痛、抗炎、保肝等作用［3-6］，還有一定的抗腫瘤、抗病毒、增強記憶的功效［7］。研究表明，柴胡醋制品中揮發油成分組成較為復雜，化合物種類多，且存在大量同分異構體，采用傳統的GC-MS進行檢測存在局限性［8］。全二維氣相色譜（GC×GC）是近年發展起來的一種新型多維色譜分離檢測技術，與飛行時間質譜（TOF/MS）聯用，適合對組分復雜試樣準確分離鑒定及微量有效成分結構的研究，廣泛應用于石油、煙草、茶類、酒類、食品安全、環境檢測、香料香精、中藥提取物［9-12］，近些年也逐步應用于植物揮發油的分析［13-14］。

本實驗以柴胡生品及柴胡醋制品為研究對象，采用全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GCTOF/MS）技術對柴胡醋制前后揮發油成分變化進行分析，旨在為柴胡醋制品的臨床應用提供理論依據，為柴胡炮制的減毒增效規律提供成分依據。

1 材料

1.1 原材料及試劑

柴胡購于河北安國藥材市場（批號：20171201），鑒定人為江西中醫藥大學龔千鋒教授；無水硫酸鈉購于西隴科學股份有限公司，分析純；無水乙醚購于國藥集團化學試劑有限公司，分析純；米醋購于山西紫林醋業股份有限公司（批號：20150809） 。

1.2 主要儀器與設備

GC×GC-TOF/MS系統、7890B氣 相 色 譜 儀、DB-Wax（30 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱、DB-17HT（2.0 m×100 μm×0.1 μm）色 譜 柱，美 國Agilent公司；Pegasus 4D飛行時間質譜儀，美國LECO公司；Heraeus Fresco17離心機、Forma 900 series型超低溫冰箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；SQP型萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ3200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；中藥粉碎機，瑞安市永歷制藥機械有限公司。

2 方法

2.1 柴胡炮制品制備

2.1.1 凈制柴胡根據《中國藥典》（2020年版），取去除雜質和殘莖的柴胡藥材，洗凈，潤透，切厚片，干燥，即得。

2.1.2 醋制柴胡根據《中國藥典》（2020年版），取柴胡飲片，加米醋拌勻（柴胡每100 kg用米醋20 kg），悶透，置炒制容器內，炒至表面呈棕黃色時，取出，放涼，即得。

2.2 柴胡炮制品揮發油制備

將柴胡生品和柴胡醋制品粉碎后過四號篩，取15 g柴胡粉末，參照《中國藥典》（2020年版）四部通則的水蒸氣蒸餾法提取揮發油［1］。收集到的揮發油用少許乙醚分數次萃取，加入適量無水硫酸鈉進行除水，低溫揮去乙醚，裝入色譜瓶，-80 ℃低溫冰箱保存。

2.3 GC×GC-TOF/MS分析方法

2.3.1 GC×GC條件柱系統由兩根色譜柱組成：色譜柱1：DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），色譜柱2：DB-17HT（2.0 m×100 μm×0.1 μm），柱子之間通過毛細管柱連接器連接。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。操作條件：升溫程序從40 ℃開始，保持3 min，以10 ℃/min速率升到150 ℃，再以5 ℃/min速率升到250 ℃，保留26 min。進樣口采用分流模式，進樣量為1.0 μL，隔墊吹掃流速為3 mL/min。

2.3.2 MS條件采用電子電離源，電子轟擊能量為-70 eV；前進樣口溫度為260 ℃，傳輸線溫度為270 ℃，離子源溫度為220 ℃；質量掃描范圍為20～500m/z，掃描速率為100 spectrum/s，溶劑延遲為0 min。

2.4 數據統計分析

數據處理使用Chroma TOF軟件對質譜數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析［15］。

3 結果

3.1 GC×GC-TOF/MS方法的建立

與傳統的一維氣相色譜-質譜聯用技術相比，GC×GC-TOF/MS集成了全二維氣相色譜技術和飛行時間質譜技術的優點，具有高分辨率、高靈敏度、高峰容量及高采集速率等優勢。全二維氣相色譜是將兩根不同極性不同長度的氣相色譜柱通過一個環形調制器串聯在一起，選用非極性柱作為第一維柱，組分按沸點高低分離；以中等極性柱作為第二維柱，組分以極性大小分離，第一根色譜柱上分離后的樣品在經過環形調制器時被迅速冷卻聚焦，然后被脈沖式熱氣迅速氣化，進入第二根色譜柱快速分離，經由快速的高分辨飛行時間質譜檢測器進行全二維譜圖的準確構建，實現復雜組分的分析。由于柴胡揮發油成分種類較多，沸程較寬，實驗選擇升溫速率為10 ℃/min，化合物主要分布在中段和后段時間出峰，避免降低第一維柱的分辨率，后段選擇較慢的升溫速率5 ℃/min。

3.2 柴胡醋制前后揮發油成分定性分析

通過GC×GC-TOF/MS譜圖所計算得到的結果對柴胡醋制前后揮發油進行定性分析，得到柴胡醋制前后揮發油的二維輪廓圖，見圖1。通過Pegasus 4D色譜分析工作站，結合Mainlib譜庫、Replib譜庫、NIST譜庫以及Wiley譜庫對柴胡醋制前后揮發油總離子流圖進行自動解卷積和檢索分析（選擇RSN＞50的色譜峰進行分析），再結合全二維包含結構信息的二維譜圖，通過族分離和結構譜圖鑒定，以及文獻對照，選取匹配度大于750、含量大于0.010%的化合物。從在兩種柴胡炮制品揮發油中共檢測到了85種化合物，可將鑒定出的化合物分為8類，其中有機酸類14種，烴類22種，醛酮類11種，酯類5種，醇類11種，醚類7種，含氮類9種，其他類6種，見表1。兩種柴胡炮制品揮發油中有28種共有成分，其中有機酸類7種，烴類3種，醛酮類6種，酯類1種，醇類5種，醚類3種，含氮類1種，其他類2種。柴胡經醋制后，亞麻酸等35種化學成分消失，新增加2，4-壬二烯醛等22種化學成分。

表1 柴胡揮發油GC×GC-TOF/MS分析鑒定的主要成分

圖1 柴胡炮制品揮發油的GC×GC二維點陣圖

（續表）

3.3 柴胡醋制前后揮發油成分定量比較分析

柴胡醋制后，揮發油成分含量發生了明顯的變化，如表1所示，有機酸類、醛酮類、醇類及酯類化合物相對含量降低；而烴類、醚類和含氮類化合物相對含量有所升高。醇類化合物是柴胡生品中相對含量較高的一類化合物，其中2-乙烯氧基乙醇的相對含量最高，達到10.534%，其在柴胡醋制品中相對含量只有2.194%。含氮類化合物是柴胡醋制品中相對含量最高的一類化合物，其中Tetramethylammonium及D-氨基葡萄糖酸相對含量分別達到8.004%和9.677%，而在柴胡生品中未檢測出這兩個化合物，且含氮類化合物柴胡生品中相對含量只有0.348%。此外，柴胡醋制前后烴類化合物相對含量變化也較大，在柴胡生品中只有0.621%，經醋制后增加到7.541%。柴胡生品檢測到的有機酸類化合物中亞油酸（1.729%）、亞麻酸（3.915%）、硬脂炔酸（1.430%）、硬脂酸（1.375%）等化合物相對柴胡醋制品中相對含量較高。在柴胡生品中檢測到的4-甲基苯丁酮（2.411%）、正己醛（0.345%）和戊醛（0.302%）等物質相對柴胡醋制品中相對含量較高。

4 討論

中藥材揮發油成分組成復雜，主要為月桂烯和己醛等短鏈烯醛［16］，經現代藥理研究發現，柴胡揮發油具有清熱解表、鎮痛、抗炎等作用。霍夢逸等［17］對柴胡揮發油中有效解熱成分進行研究，實驗結果表明柴胡揮發油的主要解熱物質為月桂醛、γ-古蕓烯和2，4-葵二烯醛等。柴胡醋制品相比生品，具有更大的潛在肝保護作用［18］。現代藥理實驗研究發現，醋制柴胡有益于膽汁分泌，在治療黃疸，肝炎，肝硬化和肝癌等肝相關疾病方面效果明顯，但醋制柴胡肝保護作用的確切分子機制仍不清楚，還需要進行更加深入的研究。

傳統的氣相色譜-質譜的靈敏度和分辨率較低，檢測出的成分較少；而全二維氣相色譜-飛行時間質譜具有更高靈敏度和和更大的峰容積，使得定性分析結果更準確［19］，并可鑒定出更多的成分。運用全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術，對柴胡醋制前后揮發油成分進行定性分析，有效解決了柴胡炮制品中復雜揮發油組分定性定量分析難題，為后續醋制柴胡代謝組學研究提供了數據支持。