高效液相色譜法測(cè)定1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑中 雜質(zhì)3-甲基吡啶

吳艷嬌，張 鐸，李永娜，鄔美男

（北京思農(nóng)源信息咨詢有限公司，北京通州 101149）

氯蟲苯甲酰胺是第一個(gè)具有新型鄰酰胺基苯甲酰胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)的廣譜殺蟲劑，由DuPont公司發(fā)現(xiàn)并開發(fā)。該劑的主要作用機(jī)制是激活昆蟲蘭尼堿受體，使昆蟲釋放平滑肌和橫紋肌細(xì)胞內(nèi)貯存的鈣離子，使肌肉調(diào)節(jié)功能減弱、害蟲麻痹，甚至死亡[1]。此物質(zhì)對(duì)鱗翅目、鞘翅目葉甲科、雙翅目潛蠅科、煙粉虱等多種害蟲的防治效果顯著，廣泛應(yīng)用于煙草、水稻和果蔬的害蟲防治[2-3]。

3-甲基吡啶又稱3-皮考林，是重要的醫(yī)藥、化工原藥。歐盟登記規(guī)定了氯蟲苯甲酰胺原藥中3-甲基吡啶為相關(guān)雜質(zhì)，其含量不能高于3 g/kg[4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2020年公布了相關(guān)雜質(zhì)清單，其中將3-甲基吡啶列為氯蟲苯甲酰胺的相關(guān)雜質(zhì)之一。

國(guó)內(nèi)關(guān)于氯蟲苯甲酰胺的測(cè)定方法報(bào)道較多，而關(guān)于3-甲基吡啶的測(cè)定方法報(bào)道較少，目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中僅有液相色譜法[5]。目前尚未見對(duì)氯蟲苯甲酰胺中3-甲基吡啶的檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。 本文建立了氯蟲苯甲酰胺制劑中3-甲基吡啶的液相色譜分析方法，滿足氯蟲苯甲酰胺系列產(chǎn)品質(zhì)量控制和登記資料需求。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

KH-500型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Aglient 1200型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器、四元低壓輸液泵、脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 試劑與材料

3-甲基吡啶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1 %，阿拉丁試劑上海有限公司）；冰乙酸（分析純，南京化學(xué)試劑廠）；磷酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙酸銨（色譜純，阿拉丁試劑上海有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia Company, Inc）；水為二次重蒸水；1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑由某農(nóng)藥企業(yè)提供（氯蟲苯甲酰胺含量0.25%）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱為Zorbax EclpisePlus-C18柱 （250 mm × 4.6 mm ID, 5 μm），柱溫為30 ℃；流動(dòng)相為乙腈/冰乙酸-乙酸銨水溶液（1 L水中加入3 g冰乙酸、3.85 g乙酸銨，超聲溶解，過0.45 μm濾膜），采用梯度洗脫程序（表1），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在該色譜條件下，3-甲基吡啶的保留時(shí)間約為5.5 min。

表1 流動(dòng)相梯度條件

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液母液：準(zhǔn)確稱取3-甲基吡啶標(biāo)樣0.038 1 g （精確至0.000 2 g）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)母液，用甲醇稀釋至1 000 mL，得到3-甲基吡啶的質(zhì)量濃度為0.38 mg/L。

1.3.3試樣溶液的制備

稱取粉碎的1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑試樣5.0 g （精確至0.000 2 g） 于150 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100 mL甲醇，將樣品超聲5～10 min溶解完全后，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

1.3.4 測(cè)定

在上述色譜操作條件下，待儀器穩(wěn)定后進(jìn)2針標(biāo)準(zhǔn)溶液，待2針溶液的峰面積相對(duì)變化不大于10%，然后按標(biāo)準(zhǔn)溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序依次進(jìn)樣。

1.3.5 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中3-甲基吡啶的峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中3-甲基吡啶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1（%）按式⑴計(jì)算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中3-甲基吡啶的峰面積平均值；A2為試樣溶液中3-甲基吡啶的峰面積平均值；m1為標(biāo)樣溶液中3-甲基吡啶的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；w為標(biāo)樣中3-甲基吡啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；1 000為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于3-甲基吡啶呈弱酸性，為了使其峰形對(duì)稱且具有良好的分離度，本文分別采用了乙腈/0.04%磷酸水溶液（5/95，體積比）、乙腈/冰乙酸-乙酸銨水溶液（1 L水中加入3 g冰乙酸和3.85 g乙酸銨） （15/85，體積比）為流動(dòng)相。

當(dāng)采用乙腈和0.04%磷酸為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形對(duì)稱，但保留時(shí)間較短，其后面的負(fù)峰對(duì)其準(zhǔn)確定量有一定影響，典型標(biāo)樣色譜圖見圖1A。當(dāng)采用乙腈/冰乙酸-乙酸銨水溶液=15/85為流動(dòng)相時(shí)，3-甲基吡啶的保留時(shí)間約為5.5 min，色譜峰形對(duì)稱，分離度良好，典型標(biāo)樣和試樣色譜圖見1B和圖2。從圖1B和圖2可見，3-甲基吡啶附近無雜質(zhì)干擾，能滿足3-甲基吡啶定量分析要求。

圖1 3-甲基吡啶標(biāo)樣的色譜圖

圖2 試樣的色譜圖

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采集190～400 nm的光譜數(shù)據(jù)，從3D譜圖分析可知，3-甲基吡啶的最大吸收波長(zhǎng)為262 nm，因此選擇262 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)下3-甲基吡啶的靈敏度最高，且無雜質(zhì)干擾。

2.3 方法的線性關(guān)系

移取適量標(biāo)準(zhǔn)母液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到3.8 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用甲醇逐級(jí)稀釋，得到3-甲基吡啶質(zhì)量濃度分別為0.095、0.19、0.38、0.76、3.8 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.1節(jié)色譜操作條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度溶液重復(fù)測(cè)定3次。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。可見，3-甲基吡啶峰面積與其質(zhì)量濃度之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表2 3-甲基吡啶的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

2.4 方法的定量限

在1.3.1節(jié)色譜條件下測(cè)定3-甲基吡啶標(biāo)樣（0.095 mg/L）。選擇3-甲基吡啶色譜峰附近的一段基線作為噪聲，利用chemisation軟件進(jìn)行信噪比分析。該濃度下，信噪比為16.9。因此10倍信噪比儀器的定量限為0.056 mg/L。按照1.3.3節(jié)中方法配制試樣溶液，方法的定量限為1.12 mg/kg。目前國(guó)內(nèi)雖然公布了氯蟲苯甲酰胺中的相關(guān)雜質(zhì)，但并未規(guī)定雜質(zhì)限量。根據(jù)歐盟登記原藥中3-甲基吡啶的限量，含量為0.25%氯蟲苯甲酰胺的1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑中3-甲基吡啶的限量為7.8 mg/kg，方法定量限完全滿足3-甲基吡啶的定量要求。

2.5 樣品的測(cè)定

按1.3.2節(jié)配制1%氯蟲·噻蟲胺顆粒劑試樣溶液，分別平行制備5份試樣溶液。在1.3.1節(jié)色譜條件下檢測(cè)3-甲基吡啶含量，典型試樣色譜圖參見圖4。可以看出，所有試樣中均未檢出3-甲基吡啶。

圖4 試樣中3-甲基吡啶標(biāo)樣的色譜圖（未檢出）

2.6 方法的準(zhǔn)確度

采用添加法，稱量試樣5.0 g于150 mL錐形瓶中，加入1.0 mL 37.8 mg/L 3-甲基吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到加標(biāo)試樣含量為7.6 mg/kg，再準(zhǔn)確加入99.0 mL甲醇，超聲5～10 min溶解后，冷卻至室溫后，過濾。平行制備5個(gè)樣品，在1.3.1節(jié)色譜條件下測(cè)定（表3）。可見，3-甲基吡啶的回收率為101.1%～106.6%，平均回收率104.9%，說明該方法的準(zhǔn)確度滿足痕量組分定量要求。典型的加標(biāo)試樣色譜見圖3。

圖3 3-甲基吡啶的3D光譜圖

表3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

3 結(jié) 論

利用反相高效液相色譜儀建立了一種梯度洗脫測(cè)定氯蟲苯甲酰胺中雜質(zhì)3-甲基吡啶的方法。該方法回收率為101.1%～106.6%，所得回歸方程線性范圍寬（0.095～3.8 mg/L），相關(guān)性良好，方法定量限低（1.12 mg/kg），為生產(chǎn)企業(yè)的氯蟲苯甲酰胺系列產(chǎn)品注冊(cè)、生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和產(chǎn)品貿(mào)易提供了切實(shí)可行的分析檢測(cè)手段。