降尿酸方對高尿酸血癥大鼠腎損傷及腎組織EZH2表達的影響

周嘉寶，劉秋玉，王傳旭，陸黎黎，徐黎，高建東

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)腎病研究所，上海中醫(yī)藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

高尿酸血癥是由血尿酸（SUA）生成增加或排泄減少引起的代謝性疾病。SUA穩(wěn)態(tài)改變與腎損傷密切相關(guān)。研究表明，治療高尿酸血癥可延緩慢性腎臟病（CKD）的進展。高水平尿酸使腎臟抗凋亡和促凋亡蛋白表達失衡，釋放趨化因子和細胞因子，引起慢性炎癥和腎纖維化，最終導致腎功能衰竭。目前，臨床常用降尿酸藥物如別嘌醇、非布司他等被作為腎臟保護劑，但其引起的過敏、心血管風險等不良反應不可忽視。

表觀遺傳修飾主要包括DNA的共價修飾和組蛋白的翻譯后修飾，與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Zeste基因增強子人類同源物2（EZH2）是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3），抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2和H3K27me3在體外培養(yǎng)的腎成纖維細胞、單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠和CKD患者腎組織中高表達，抑制EZH2可阻斷高尿酸血癥小鼠腎組織H3K27me3和Cleaved Caspase-3表達，還可降低SUA，減輕腎損傷和纖維化。

降尿酸方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腎病科根據(jù)“活血通絡、化痰降濁”治法總結(jié)創(chuàng)立的經(jīng)驗方，該方在減輕尿酸性腎病患者腰酸乏力等不適癥狀、降低血尿酸、抑制腎纖維化、保護腎功能等方面有一定作用，但具體作用機制尚不清楚。因此，本研究通過制備高尿酸血癥大鼠模型，觀察降尿酸方對高尿酸血癥大鼠腎損傷及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2表達的影響，為高尿酸血癥及其腎損傷的中醫(yī)藥治療提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號SYXK（滬）2018-0016。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心室溫25 ℃、相對濕度45%環(huán)境，自由攝食飲水，適應性喂養(yǎng)1周。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學倫理委員會審批（SZY201604006）。

1.2 藥物

降尿酸方（酒大黃10 g，粉萆薢10 g，炒王不留行10 g，威靈仙15 g，鹽車前子15 g，炒芥子10 g，山楂10 g），免煎顆粒購自江陰天江藥業(yè)有限公司，蒸餾水加熱溶解，制成濃度為1.6 g/mL藥液。別嘌醇緩釋膠囊，規(guī)格0.25 g/粒，黑龍江澳利達奈德制藥有限公司，批號18030901，取內(nèi)容物，蒸餾水溶解，制成濃度為2.5 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀，山東中科泰斗有限公司，批號080601；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），上海麥克林生化科技有限公司，批號C10097951；Cleaved Caspase-3抗體，美國CST公司，貨號9661S；Bax抗體，英國Abcam公司，貨號ab182733；Bcl-2抗體，美國ABclonal公司，貨號A0208；GAPDH抗體，美國Proteintech公司，貨號60004-1-Ig；EZH2抗體，美國CST公司，貨號5246；H3K27me3抗體，美國CST公司，貨號9733；Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）抗體，美國Affinity公司，貨號AF7001；Ⅳ型膠原蛋白（ColⅣ）抗體，美國Affinity公司，貨號AF0510；HRP標記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號分別為A0216、A0208；細胞凋亡試劑盒，瑞士Roche公司，貨號11684817910；PVDF膜，美國 Millipore公司，貨號 IPVH00005。離心機（美國Beckman公司，型號Avanti J-E），電泳及轉(zhuǎn)膜電源儀（美國 Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號 Tanon-5200），生物組織冷凍包埋機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-BM），攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-P），烘片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-H）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

40只大鼠隨機分為正常組、模型組、降尿酸方組和別嘌醇組，每組10只。實驗第1日起，除正常組外，其余各組大鼠予氧嗪酸鉀溶液 1 500 mg/kg灌胃，6 h后降尿酸方組和別嘌醇組分別按16 g/kg、25 mg/kg予降尿酸方和別嘌醇灌胃（相當于60 kg成人臨床用藥量6倍），給藥體積10 mL/kg，正常組和模型組予生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。

2.2 樣本收集

給藥結(jié)束后，使用代謝籠收集大鼠24 h尿液檢測24 h尿蛋白（UTP），目內(nèi)眥采血檢測大鼠血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、SUA，樣品送至上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科檢測。2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，摘取雙側(cè)腎臟，分別進行病理觀察、免疫組化染色和Western blot檢測。

2.3 病理觀察

取大鼠腎組織，90%乙醇固定24 h，梯度乙醇脫水，浸蠟、石蠟包埋、切片（3 μm），脫蠟后行HE、Masson染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)。

2.4 細胞凋亡檢測

腎組織石蠟切片脫蠟至水，加入 Proteinase K，室溫孵育30 min，TUNEL染色，滴加converter-POD，室溫避光孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，光鏡下觀察細胞凋亡情況，以細胞核黃褐色為陽性結(jié)果。

2.5 免疫組化染色

腎組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，3%BSA室溫封閉30 min，加入ColⅠ（1∶50）、ColⅣ（1∶50）、Cleaved Caspase-3（1∶400）、EZH2（1∶50）一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育50 min，DAB顯色，中性樹脂封片，光鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達。使用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計陽性表達的積分光密度（IOD）和陽性染色面積（Area），計算平均光密度（MOD）。MOD＝IOD/Area。

2.6 Western blot檢測

RIPA裂解液裂解大鼠腎組織，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉40 min，分別加入Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、EZH2（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，加入HRP標記山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000）二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 降尿酸方對模型大鼠腎功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠 SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平比較（±s）

4.2 降尿酸方對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管管腔擴張、管壁變薄，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、纖維化明顯，細胞外基質(zhì)增多；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎小管管腔擴張、炎性細胞浸潤、纖維組織增生明顯減輕。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson染色，×200）

4.3 降尿酸方對模型大鼠腎組織細胞凋亡的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織凋亡細胞數(shù)量明顯增加，凋亡細胞主要為腎小管細胞；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織凋亡細胞數(shù)量明顯減少。見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×400）

4.4 降尿酸方對模型大鼠腎組織Ⅰ、Ⅳ型膠原蛋白表達的影響

免疫組化染色顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織ColⅠ、ColⅣ蛋白表達明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織ColⅠ、ColⅣ蛋白表達明顯降低（＜0.05，＜0.01）。見圖4、圖5、表2。

表2 各組大鼠腎組織ColⅠ和ColⅣ蛋白表達比較（±s，MOD）

圖4 各組大鼠腎組織ColⅠ蛋白陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠腎組織ColⅣ蛋白陽性表達（免疫組化染色，×200）

4.5 降尿酸方對模型大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2和H3K27me3蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織 Cleaved Caspase-3、Bax、EZH2、H3K27me3蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、EZH2、H3K27me3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見圖6、表3。Cleaved Caspase-3和EZH2免疫組化結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。見表4、圖7、圖8。

圖6 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2和H3K27me3蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、EZH2、H3K27me3蛋白表達比較（±s，相對表達量）

表4 各組大鼠腎組織 Cleaved Caspase-3、EZH2蛋白表達比較（±s，MOD）

圖7 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase-3蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖8 各組大鼠腎組織EZH2蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

5 討論

高尿酸血癥是CKD的獨立危險因素，高水平尿酸可觸發(fā)腎臟內(nèi)細胞氧化應激、炎性反應、內(nèi)皮損傷、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活。體外實驗顯示，尿酸能刺激腎小管上皮細胞凋亡和間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，直接或間接誘導腎臟成纖維細胞活化，促進腎纖維化進展。對于動物模型建立，研究顯示，大鼠予氧嗪酸鉀750 mg/kg灌胃5周后出現(xiàn)腎臟動脈病變、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化等病理變化。Cristóbal-García 等給予大鼠氧嗪酸鉀 750 mg/kg連續(xù)灌胃 11～12周后，大鼠出現(xiàn)高血壓、腎血管收縮、腎小管損傷、氧化應激、線粒體功能障礙等變化。Liu等通過給予腺嘌呤和氧嗪酸鉀1 500 mg/kg混合液灌胃建立高尿酸血癥大鼠模型，實驗第4周大鼠腎組織ColⅠ表達升高。本實驗以氧嗪酸鉀1 500 mg/kg灌胃作為高尿酸血癥大鼠的造模方法，實驗第 12周模型大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平明顯升高（＜0.05），腎組織出現(xiàn)纖維化病理特征，纖維化指標ColⅠ、ColⅣ蛋白表達升高，凋亡細胞明顯增多，促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，提示大鼠出現(xiàn)腎功能下降和早期腎纖維化表現(xiàn)。給予降尿酸方干預后，大鼠SCr、BUN、SUA和24 h UTP水平顯著降低（＜0.05），腎組織纖維化程度減輕，ColⅠ、ColⅣ蛋白表達降低，凋亡細胞明顯減少，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，提示降尿酸方在治療大鼠高尿酸血癥同時可減輕高尿酸誘導的腎纖維化。

表觀遺傳修飾通過調(diào)控基因表達影響細胞生長、增殖等，在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。組蛋白修飾與多梳抑制復合物 2（PRC2）密切相關(guān)，EZH2是重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶之一，作為 PRC2的催化亞基，在H3K27處觸發(fā)組蛋白H3甲基化，在促纖維化基因表達和調(diào)節(jié)腎纖維化中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者腎組織EZH2表達升高，表明EZH2升高與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展具有臨床相關(guān)性，并且可能與腎纖維化發(fā)病機制有關(guān)。Barrera-Chimal等發(fā)現(xiàn)，EZH2抑制劑或EZH2 siRNA可抑制腎間質(zhì)成纖維細胞激活、細胞外基質(zhì)沉積和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，且抑制EZH2能緩解高尿酸血癥小鼠腎小管細胞凋亡及炎性反應。還有研究顯示，抑制EZH2能阻止 TGF-β1/Smad3信號通路和 EGFR/ERK1/2信號通路激活，抑制多種促腎纖維化趨化因子和細胞因子分泌。Shi等在高尿酸誘導的腎損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制EZH2可降低EZH2、Cleaved Caspase-3水平，減輕腎小管上皮細胞凋亡，降低SUA、黃嘌呤氧化酶活性，減輕腎間質(zhì)纖維化。本研究建立高尿酸血癥伴腎損傷、早期腎纖維化大鼠模型，觀察其EZH2水平，結(jié)果顯示，降尿酸方可降低模型大鼠腎組織EZH2蛋白表達，減輕腎組織病理損傷。

中醫(yī)學認為，痰濕、血瘀在高尿酸血癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。病程初期飲食不節(jié)或先天不足，致痰濕內(nèi)生，阻滯中焦；中期久病入絡或臟氣衰退，痰瘀互結(jié)；后期邪傷臟腑，腎元衰竭。治宜活血化瘀、化痰降濁，據(jù)此創(chuàng)立降尿酸方，方中炒芥子、鹽車前子為君，利氣豁痰、溫中散寒、利小便、通腎氣；炒王不留行為臣，祛痰行血通絡；佐以粉萆薢、威靈仙祛風除濕、通絡止痛，山楂消食健胃、行氣散瘀，酒大黃瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)。

綜上所述，降尿酸方可減輕高尿酸血癥大鼠腎損傷，抑制早期腎纖維化發(fā)展，改善腎功能，其機制可能與抑制細胞凋亡、降低腎組織EZH2表達有關(guān)。