玉米赤霉烯酮間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立

唐 頌，李巖松，尚翠玲，胡 盼，盧士英，任洪林，柳增善，周 玉,2,

（1.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，吉林長(zhǎng)春 130062；2.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434023）

真菌毒素是一類(lèi)由真菌產(chǎn)生的在自然界廣泛存在的小分子代謝產(chǎn)物，世界上近1/4的糧食作物受到真菌毒素的污染，其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是玉米、小麥等糧食作物中污染最為廣泛的真菌毒素之一[1]。朱風(fēng)華等對(duì)2017～2019年我國(guó)山東省6000余份飼料樣品進(jìn)行真菌毒素污染狀況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)玉米中ZEN污染率接近50%，并有逐年增高的趨勢(shì)[2-4]。ZEN具有很高的熱穩(wěn)定性，在糧食生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程中很難被完全去除，通過(guò)食物進(jìn)入人體后嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康[5-6]。而ZEN通過(guò)飼料進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖機(jī)能，導(dǎo)致流產(chǎn)[7-8]；并抑制動(dòng)物的免疫功能，誘發(fā)腫瘤[9]。

目前，全球100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都制定了ZEN的限量標(biāo)準(zhǔn)。如歐盟對(duì)原糧玉米中的ZEN限量為350 μg/kg，對(duì)粗加工玉米粉產(chǎn)品及人類(lèi)食用需要再加工的其他玉米研磨制品的ZEN限量為200 μg/kg，對(duì)原糧谷物與可直接食用的玉米的ZEN限量為100 μg/kg，對(duì)嬰幼兒加工食品中的ZEN限量為20 μg/kg[10]；我國(guó)對(duì)玉米、玉米面、小麥和小麥粉中ZEN的限量為60 μg/kg[11]。除嬰幼兒食品外，單純從數(shù)值上看我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)比歐盟更嚴(yán)格，但糧食的限量種類(lèi)僅玉米和小麥兩種，原糧與成品糧的品種限量標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，且糧食在生產(chǎn)加工和貯存中會(huì)使毒素的含量增多，另外歐盟對(duì)嬰幼兒這類(lèi)特殊人群食品的限量標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)低于目前我國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立一種ZEN的高靈敏度檢測(cè)法對(duì)保障糧食安全十分必要。

基于儀器分析技術(shù)的高效液相色譜法、熒光光度計(jì)法、液相色譜-質(zhì)譜法是食品中ZEN的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法[12]，薄層色譜法和ELISA是國(guó)標(biāo)飼料中的檢測(cè)方法[13]，這些儀器分析方法具有檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)需要大型的儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)的操作人員，不便于基層或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[14]。而間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）在ZEN的檢測(cè)中具有操作簡(jiǎn)單快捷、普通從業(yè)人員便可操作、能夠滿(mǎn)足基層或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中大批樣品的初篩鑒定等優(yōu)勢(shì)。為了增加ic-ELISA靈敏度，多使用各種生物傳感元件或納米材料在ELISA中起到信號(hào)放大的目的，在此基礎(chǔ)上可以使傳統(tǒng)ic-ELISA方法[15]的靈敏度由1900 ng/mL提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)[16-17]，但是這些改進(jìn)的ELISA方法使ELISA的操作變得更加復(fù)雜。傳統(tǒng)ic-ELISA在快速免疫檢測(cè)中仍然是最簡(jiǎn)單實(shí)用、成本低廉、商業(yè)化產(chǎn)品最多的檢測(cè)類(lèi)型。提高ELISA檢測(cè)靈敏度最核心的的問(wèn)題還是提高目標(biāo)抗體的特異性和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)選一組高質(zhì)量的商品化的抗原、抗體，以期建立高靈敏的ic- ELISA檢測(cè)方法并用于后續(xù)相關(guān)免疫檢測(cè)方法研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ZEN、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol, DON）、伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）、T-2毒素（T-2）標(biāo)準(zhǔn)品 青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白偶聯(lián)ZEN抗原（ZEN-BSA）、ZEN單抗 大連百奧思科生物有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗（HRP-IgG） 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ZEN試劑盒 北京華安麥科有限公司；玉米面吉林省長(zhǎng)春市某大型超市。

微孔板分光光度計(jì) 美國(guó)Biotek公司；高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ic-ELISA檢測(cè)基本程序 用碳酸鹽緩沖液將ZEN-BSA包被于96孔板上，每孔100 μL，37 ℃恒溫溫育2 h。洗液（含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液）清洗三次，每孔200 μL，將板內(nèi)殘余液體拍干。5%脫脂乳作為封閉劑，每孔200 μL，37 ℃恒溫封閉1 h，洗液清洗三次，拍干。競(jìng)爭(zhēng)孔加入ZEN待測(cè)樣品和磷酸鹽緩沖液稀釋的單抗各50 μL，非競(jìng)爭(zhēng)孔加入50 μL磷酸鹽緩沖液和50 μL單抗，陰性孔中加100 μL磷酸鹽緩沖液，37 ℃恒溫溫育1 h。洗液清洗三次，拍干。加入用5%脫脂乳稀釋2000倍的HRP-IgG，每孔100 μL，37 ℃恒溫溫育1 h。洗液清洗三次，拍干。加入100 μL TMB底物溶液，37 ℃避光顯色15 min。加入終止液（2 moL/L H2SO4），每孔50 μL，酶標(biāo)儀讀取450 nm處的OD值[13]。

1.2.2 ic-ELISA檢測(cè)條件優(yōu)化

1.2.2.1 包被抗原和單抗最佳工作濃度的確定 包被抗原BSA-ZEN用碳酸鹽緩沖液梯度稀釋至300、150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875 ng/mL。ZEN

單抗用磷酸鹽緩沖液稀釋至1000、500、250、125、62.5、31.25、0 ng/mL。棋盤(pán)滴定法確定抗原和單抗的最佳工作濃度。

1.2.2.2 包被條件、封閉條件和底物作用時(shí)間的確定

在“1.2.2.1”的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確定包被條件、封閉條件和底物作用時(shí)間。包被條件設(shè)置為4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、37 ℃ 0.5 h 、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h。封閉條件設(shè)置為1% BSA、0.5% BSA、5% 脫脂乳、3%脫脂乳各1 h，同時(shí)做不封閉對(duì)照組。底物作用時(shí)間設(shè)置為5、10、15、20 min。最適條件確定以P/N比值最大進(jìn)行判定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 pg/mL，用優(yōu)化后的ic-ELISA進(jìn)行測(cè)定。橫坐標(biāo)為ZEN標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為抑制率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 特異性 為確定該檢測(cè)方法的特異性，對(duì)500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 pg/mL的ZEN以及10000、1000、100、10、1 ng/mL的OTA、AFB1、DON、FB1、T-2標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行ic-ELISA檢測(cè)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算各毒素的半數(shù)抑制濃度（IC50），通過(guò)以下公式計(jì)算交叉反應(yīng)率（CR）。

1.2.5 加標(biāo)回收 稱(chēng)取4份玉米面，每份1 g，將不同濃度ZEN標(biāo)準(zhǔn)品加入到玉米面中，使玉米面ZEN含量為20、15、5、2.5 μg/kg后，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇-水溶液中，充分振蕩5 min，超聲5 min，室溫下4000×g離心10 min，取磷酸鹽緩沖液稀釋20倍的上清，進(jìn)行ic-ELISA檢測(cè)[18]。通過(guò)以下公式計(jì)算回收率。并用試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證分析，繪制擬合曲線(xiàn)。

1.2.6 方法驗(yàn)證分析 用本方法和北京華安麥科ZEN商品化試劑盒同時(shí)檢測(cè)3份ZEN加標(biāo)量為120、80、60 μg/kg的玉米面樣品，每份3個(gè)重復(fù)，試劑盒檢測(cè)步驟參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被抗原與單抗的最佳工作濃度

棋盤(pán)滴定法測(cè)定的OD450結(jié)果見(jiàn)表1，取OD450值接近1.0所對(duì)應(yīng)的抗原、單抗質(zhì)量濃度[19]，本著節(jié)省單抗的原則，確定抗原質(zhì)量濃度為75 ng/mL，單抗質(zhì)量濃度為250 ng/mL。

表1 包被抗原和單抗最佳濃度的確定Table 1 Optimal amount of coating antigen and monoclonal antibody

2.2 包被條件、封閉條件和底物作用時(shí)間的確定

包被條件與P/N值結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，4 ℃包被12和24 h的P/N值一致，37 ℃包被0.5 h P/N值較低，1和2 h的P/N值較高并接近，綜合37 ℃和4 ℃兩種條件下的P/N值，同時(shí)為了縮短檢測(cè)所需時(shí)間，選擇了37 ℃ 1 h的最佳包被條件。

圖1 抗原最佳包被條件的選擇Fig.1 Selection of optimal conditions for coating antigen

不同封閉條件與P/N值結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，不封閉和其他四種封閉P/N值之間不具有明顯差異，為節(jié)省反應(yīng)時(shí)間，故本方法不需要封閉。

圖2 最佳封閉條件的選擇Fig.2 Selection of optimal conditions for blocking plate

酶催化底物的反應(yīng)時(shí)間與P/N值結(jié)果見(jiàn)圖3。5～15 min，P/N值隨著酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在15～20 min時(shí)P/N趨于平衡。因此，選擇酶催化底物的作用時(shí)間確定為15 min。

圖3 底物最佳作用時(shí)間的選擇Fig.3 Selection of optimal reaction time of substrate

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4，以lg（ZEN的濃度）為自變量x，以抑制率的百分?jǐn)?shù)為因變量y建立的曲線(xiàn)回歸方程為：y=42.19x-23.994，R2=0.9919。線(xiàn)性檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80）為11～292 pg/mL，檢測(cè)限（IC10）為6 pg/mL，靈敏度（IC50）為57 pg/mL。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve

2.4 特異性

該方法與5種常見(jiàn)真菌毒素的交叉反應(yīng)見(jiàn)表2。與OTA、AFB1、DON、FB1、T-2毒素均無(wú)交叉反應(yīng)，表明本方法具有良好特異性。

表2 單抗與其他5種真菌毒素的交叉反應(yīng)率Table 2 Cross-reactivity of monoclonal antibody with 5 mycotoxins

2.5 回收率

玉米面ZEN加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出平均回收率為81.29%～105.80%，變異系數(shù)小于10%，建立的ic-ELISA方法可滿(mǎn)足實(shí)際樣品中ZEN的檢測(cè)需要。

表3 玉米面中添加ZEN回收率Table 3 ZEN recovery added in corn flour

2.6 方法驗(yàn)證分析

采用ZEN商品化ELISA試劑盒和本文建立方法同時(shí)對(duì)ZEN加標(biāo)樣品進(jìn)行驗(yàn)證分析，結(jié)果如圖5所示：以本方法的檢測(cè)值為自變量x，以商品化試劑盒的檢測(cè)值為因變量y建立的曲線(xiàn)回歸方程為y=1.0267x-1.8403，R2=0.972（相關(guān)性較好）。因此，本方法適用于在玉米面中快速篩查ZEN。

圖5 ic-ELISA與商品化ELISA試劑盒相關(guān)性Fig.5 Correlation between ic-ELISA and commercial ELISA kit

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)建立的ZEN常規(guī)ic-ELISA方法靈敏度（IC50）達(dá)到了57 pg/mL，優(yōu)于文獻(xiàn)[15,20]報(bào)道的常規(guī)ELISA方法靈敏度1900 pg/mL和130 pg/mL。此外，為提高ELISA檢測(cè)靈敏度，一些生物傳感器被引入ELISA中[21]。Liu等[17]基于親和素-生物素放大系統(tǒng)使IC50達(dá)到180 pg/mL；肖佳麗等[16]基于納米磁珠偶聯(lián)ZEN抗原和ZEN單抗雙標(biāo)探針使IC50達(dá)到220 pg/mL；Liu等[22]基于納米磁珠-偶聯(lián)噬菌體模擬物（替代抗原）和化學(xué)發(fā)光底物建立ZEN的磁性噬菌體化學(xué)發(fā)光酶免疫（P-MCLEIA）檢測(cè)方法中IC50達(dá)到31.4 pg/mL，這些生物傳感器的引入都相對(duì)于傳統(tǒng)ELISA方法提高了靈敏度，但也增加了額外的探針制備過(guò)程和檢測(cè)步驟。本實(shí)驗(yàn)建立的ic-ELISA方法，其靈敏度與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中液相色譜-質(zhì)譜法[12]相當(dāng)，優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的熒光光度計(jì)法、高效液相法[12]、薄層色譜法和ELISA[13]，能夠滿(mǎn)足玉米面中ZEN的痕量快速檢測(cè)。

傳統(tǒng)ELISA方法靈敏度主要受抗原、抗體性質(zhì)決定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該ZEN抗體具有較好的特異性和靈敏度。后續(xù)將在前期完成ic-ELISA的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)其它快速免疫學(xué)檢測(cè)方法。