抗炎低聚糖的制備及其抗炎機制研究進展

黃嘉歡，張銘儒，羅露香，姜曉琳，楊 全，程軒軒

（廣東藥科大學中藥學院，國家中醫藥管理局嶺南藥材生產與開發重點研究室，國家中藥材產業技術體系廣州綜合試驗站，廣東省南藥規范化種植與綜合開發工程技術研究中心，廣東廣州 510006）

炎癥（Inflammation）是具有血管系統的活體組織對致炎因子所發生的防御反應。一般情況下，炎癥是有益的，可以清除致炎因子造成的壞死細胞和組織，并修復損傷部位。但當致炎因子持續存在或增加時就會激活炎癥信號通路，促進大量促炎因子的產生，炎癥會轉變成慢性疾病或者向全身擴散，導致病情加重或難以治愈[1-3]。體表的外傷感染和各器官的常見病（如腸炎、肝炎、腎炎等）均屬于炎癥性疾病。研究發現，許多癌癥也是由炎癥反應和慢性刺激造成的[4]。

低聚糖是通過糖苷鍵將2～10個單糖分子連接而成的化合物總稱，又稱寡糖或寡聚糖，包括普通低聚糖和功能性低聚糖兩種。普通低聚糖易被機體消化吸收，如蔗糖、麥芽糖、環糊精等。功能性低聚糖不易被機體消化吸收，但能促進腸道有益菌增殖和抑制有害菌，并減少有毒發酵產物的形成，如低聚木糖、褐藻膠低聚糖、低聚殼聚糖等。研究證實低聚糖能通過抑制炎癥細胞的促炎因子表達和抑制炎癥通路的激活[5-9]，在急性結腸炎[10-14]、脂肪肝炎[15]、糖尿病腎炎[16]、神經炎[17]等多種炎癥性疾病的治療中發揮作用。低聚糖的原材料獲取簡單，在食品保鮮、保健品、醫藥和畜牧業等領域有較好的應用前景。本文綜述了近年來抗炎低聚糖的制備方法及抗炎機制的研究進展，旨在為新型抗炎藥物開發提供參考。

1 抗炎低聚糖的種類及其制備方法

低聚糖多來源于自然界，如植物膠、海洋藻類多糖、動物乳汁、甲殼類動物等，一般通過化學法、物理法或者酶法獲得。相較于化學法和物理法，酶法具有反應條件溫和、綠色環保、產率高和產品均一性好等優點。因此，酶法制備低聚糖已成為近年來低聚糖工業化生產的研究重點。

1.1 來源于植物的低聚糖

1.1.1 低聚半乳糖醛酸 低聚半乳糖醛酸（Oligogalacturonic acid，OGA）是由2～10個半乳糖醛酸通過α-1,4糖苷鍵線性連接而成的聚合物，一般通過物理法、化學法和酶法降解果膠的主要成分——多聚半乳糖醛酸得到[18]。鑒于物理法和化學法隨機性較大，難以控制產物聚合度和結構類型，目前酶法應用比較廣泛。研究者們分別從曲霉菌和嗜熱腐質霉菌中克隆得到內切多聚半乳糖醛酸酶基因PgaB[19]、果膠裂解酶基因plhy1[20]，進而在畢赤酵母中實現高效表達，并對表達條件進行了優化，最終獲得不同聚合度的OGA。篩選具有優異的穩定性和高效性的酶，利用低成本的農業食品工業廢物（如果膠）進行OGA的工業化生產，在農業食品工業中具有應用前景。

1.1.2 低聚木糖 低聚木糖（Xylo-oligosaccharide，XOS）主要由木聚糖酶降解植物細胞壁中的木聚糖所得，是由2～10個D-木糖分子通過β-1,4糖苷鍵結合而成的功能性低聚糖，主要有木二糖、木三糖和木四糖[21]。XOS主要通過物理法、化學法和酶法將玉米芯、甘蔗渣等農業副產物中的木聚糖降解獲得。酶法因反應條件溫和、易控制、轉化率較高和環境友好的優點，是目前低聚木糖工業化生產的主要方法[22]。Zhang等[23]采用0.05 mol/L氯化鎂和氯化亞鐵在140 ℃下將甘蔗渣催化30 min，制備XOS，產率可達54.68%，產物以木二糖和木三糖為主。Nieto-Dominguez等[24]采用GH11家族的內切木聚糖酶XynM降解樺木木聚糖，產物為聚合度2～4的XOS，產率為28.8%。Liu等[25]利用GH10家族的木聚糖酶PbXyn10A可將木糖降解為聚合度2～3的XOS，產率高達75%。近年來，由于XOS廣泛應用于食品、醫藥、農業和畜牧業等領域，木聚糖酶受到了廣泛關注，其中GH10和GH11木聚糖酶具有相對較寬的底物特異性，是目前制備XOS的最佳用酶。

1.1.3 低聚果糖 低聚果糖（Fructo-oligosaccharide，FOS）是蔗糖分子以β-1,2糖苷鍵與1～3個D-果糖基結合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及混合物[26]。商品FOS主要通過蔗糖合成或菊糖降解的方法進行制備，后者通過從自然界來源的菊苣、洋薊、大麗花或龍舌蘭的根中水解獲得，工藝簡單、產品純度高、價格低廉[27]。Oliveira等[28]發現β-果糖糖苷酶能催化蔗糖發生轉移反應，具有很好的穩定性和高效催化性，可長期用于工業FOS和轉化糖的生產。Vega等[29]研究發現纖維素酶Rohapect CM在適宜條件下可將蔗糖合成為FOS，產率為63.8%。Rohapect CM是商用食品級酶制劑，能制備較高產率的FOS，可為FOS和果糖的工業化生產提供參考。

1.1.4 低聚甘露糖 低聚甘露糖（Manno-oligosaccharide，MOS）由2～7個甘露糖通過β-1,4糖苷鍵結合生成的低聚糖，其化學結構因原料來源的不同而異[21]。來源于棕櫚粕、椰肉的是低聚直鏈甘露糖，來源于魔芋、硬質木材的是低聚葡甘露糖，來源于瓜爾豆膠、槐豆膠的是低聚半乳甘露糖，來源于種子胚乳的是低聚半乳葡甘露糖（圖1）。目前主要通過物理法、化學法和酶法降解上述原料中的甘露聚糖制備MOS。Liu等[30]采用β-甘露聚糖酶ManAK將刺槐豆膠、魔芋膠和瓜爾膠降解為小分子MOS（＜2000 Da），其中將刺槐豆膠和魔芋膠水解成聚合度2～6的MOS產率分別為76.7%、83.3%。Yang等[31]發現β-甘露聚糖酶TcMAN能有效地將魔芋粉中的甘露聚糖水解成聚合度3～7的MOS，產率為97.5%。β-甘露聚糖酶具有良好的酶學特性，可批量生產，為MOS的制備提供了科學依據。

圖1 低聚甘露糖的結構類型Fig.1 Chemical structures of MOS

1.1.5 低聚異麥芽糖 低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharide，IMO），被稱為“雙歧因子”，是由2～10個葡萄糖通過α-1,6糖苷鍵結合而成的低聚糖，主要有異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖和異麥芽四糖等。目前IMO主要是以淀粉為原料通過酶法轉化生產，常用的酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等[32]。姚明靜等[33]將甘薯與α-淀粉酶共同高溫液化，在β-淀粉酶和α-葡萄糖轉苷酶的作用下，依次進行糖化轉苷反應和面包酵母發酵，最終產物中IMO含量為72.9%，比發酵前提高1倍以上。Chen等[34]以戊二醛為交聯劑，殼聚糖為載體，建立了以淀粉為底物，α-葡萄糖苷酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶和真菌α-淀粉酶同時糖化轉苷制備IMO，產物中IMO含量為41.74%。Huang等[35]研究發現在雙酶法（右旋糖酐蔗糖酶和葡聚糖蔗糖酶）合成IMO的體系中，加入麥芽糖受體，可以在一定程度上實現高質量IMO的定向制備，產率為55.56%。酶法制備IMO所涉及的酶均為常用的商用食品級酶，成本低且實用性高。工藝流程一般是先用酶法制備低純度的IMO，再采用酵母發酵、受體結合或透析等方法獲得高純度IMO。

1.1.6 海藻酸低聚糖 海藻酸低聚糖（Alginate oligosaccharide，AOS），又稱褐藻膠低聚糖，是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古羅糖醛酸（G）通過α-1,4糖苷鍵連接而成的低聚糖，存在三種聚合方式：聚甘露糖醛酸（poly M）、聚古羅糖醛酸（poly G）和雜合褐藻寡糖（poly MG）[36]。AOS是海藻酸鹽通過酶解、酸水解和氧化降解等方法解聚得到。海藻酸裂解酶作為一種重要的工具酶被廣泛應用于AOS的生產[36]。有研究者分別將海藻酸裂解酶基因Alyw201[37]和AlgA[38]在酵母或者大腸桿菌中實現高效表達，并對表達條件進行優化，最終獲得不同聚合度的AOS。酶解法已成為降解海藻酸鹽最常用的方法，穩定且高效的海藻酸裂解酶是工業化生產海藻酸低聚糖的關鍵。

1.1.7 瓊膠低聚糖 瓊脂糖是由D-半乳糖和3, 6-內醚-L-半乳糖通過β-1,4與α-1,3糖苷鍵交替連接而成的直鏈線性高分子聚合物。瓊膠低聚糖（Agaro oligosaccharide，AGO）是瓊脂糖水解后生成的聚合度2～10的低聚糖，包括瓊脂寡糖和新瓊脂寡糖兩種類型。AGO的制備方法有化學水解法和酶法，目前多采用酶法生產。α-瓊膠酶能作用于α-1, 3糖苷鍵，生成瓊二糖、四糖等寡糖，β-瓊膠酶可作用于β-1,4糖苷鍵生成新瓊二糖、新瓊四糖等寡糖。目前只有5種α-瓊膠酶被生化鑒定[39]。研究者們分別克隆了α-瓊膠酶基因AgaWS5[40]和β-瓊膠酶基因Aga3027[41]，構建表達載體并在大腸桿菌中進行表達，獲得重組蛋白。重組Aga WS5具有耐寒性，低溫（10 ℃）條件下仍可維持40%以上活性，可將瓊脂糖降解為瓊二糖、瓊四糖和瓊六糖。重組Aga3027具有良好的熱穩定性和pH穩定性，可將瓊脂糖水解為新瓊脂四糖和新瓊脂六糖。目前瓊膠酶在營養和食品工業中有較大的應用潛力。

1.2 來源于動物的低聚糖

1.2.1 低聚半乳糖 低聚半乳糖（Galactooligosaccharide，GOS）是來源于動物乳汁中的非人工合成的低聚糖，分子結構一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1～7個半乳糖基[42]。目前GOS的制備主要通過β-半乳糖苷酶的轉糖苷功能催化乳糖合成[43]。自然界中許多微生物都可以產生β-半乳糖苷酶，如黑曲霉[44]、米曲霉[45]、芽孢桿菌[46]、乳酸酵母[47]等。Gao等[48]以米曲霉Aspergillus oryzaeRIB40為出發菌株，通過原生質體誘變獲得了三株β-半乳糖苷酶產量較高的米曲霉突變菌株：N140C、W806F和N140C/W806F。通過對突變體及野生型β-半乳糖苷酶生產GOS的條件進行優化，發現三株突變體生產GOS的產率分別為50.7%（N140C）、49.3%（W806F）和59.8%（N140C/W806F），均比野生型（35.7%）有較大提高。其中雙突變體N140C/W806F具有更優異的性能，適合作為工業催化劑。通過誘變獲取β-半乳糖苷酶的突變型菌株，進而篩選高GOS產率的菌株，為COS的制備方法提供新策略。

1.2.2 低聚殼聚糖 低聚殼聚糖（Chitosan oligosaccharide，COS）又稱殼寡糖，是2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖，也是殼聚糖的水解產物[49]。COS可以通過酶法、物理方法和化學方法制備。酶法是通過專一性酶和非專一性酶降解高聚殼聚糖制備COS的方法，專一性酶主要指殼聚糖酶，非專一性酶包括纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等。目前COS主要是通過非專一性酶法獲得，但降解率和產率較低；而殼聚糖酶能克服上述缺點，是制備COS的理想有效的方法[50]。

研究者分別將殼聚糖酶基因Csn[51]和BaCsn46B[52]在畢赤酵母中實現高效表達，重組Csn可將不同脫乙酰度的殼聚糖水解為殼二糖～殼五糖；重組BaCsn46B水解殼聚糖的產物主要為殼二糖和殼三糖。為了獲得豐富的殼聚糖酶，且該酶需具有較高的溶解性，才可用于大規模生產COS，目前篩選了許多具有殼聚糖酶活性的微生物，為大規模的殼聚糖酶制備COS奠定基礎。

2 低聚糖的抗炎作用及機制

2.1 對炎癥介質的影響

2.1.1 對細胞因子的影響 細胞因子是一類具有生物活性的小分子蛋白或多肽的總稱，可分為促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等）和抑炎因子（IL-4、IL-10、IL-37、IL-38等）。研究表明，中波紫外線（Ultraviolet B，UVB）對體外培養的人永生化表皮角質形成細胞（HaCaT）輻射損傷后，TNF-α、IL-6大量分泌，引發細胞內的炎癥反應并加速細胞損傷[5]，山楂果膠低聚半乳糖醛酸提取物能通過抑制TNF-α、IL-6分泌，從而減輕UVB輻射對HaCaT細胞的損傷[53]。殼寡糖可通過抑制結腸組織中TNF-α、IL-6的分泌，從而減輕葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠急性結腸炎[10]。低聚甘露糖能有效緩解DSS所致急性結腸炎小鼠的臨床癥狀，與其下調促炎介質（IL-1α、IL-1β、IL-6、KC、GCSF和MCP-1）有關[11]。在炎癥反應中，低聚糖可以通過抑制促炎因子的釋放發揮抗炎作用。

2.1.2 對熱休克蛋白的影響 血紅素氧合酶1（Hemoxigenase-1，HO-1）是一種能將血紅素分解生成一氧化碳、鐵和膽紅素的限速酶，間接抑制促炎細胞因子、一氧化氮（Nitric oxide，NO）的產生和防止炎癥反應的惡化[54]。Enoki等[54]研究發現，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的人單核細胞體外炎癥模型中，瓊脂寡糖能上調HO-1蛋白表達；在LPS誘導的活化巨噬細胞體外炎癥模型中，瓊脂寡糖通過上調HO-1蛋白表達而抑制亞硝酸鹽和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）的產生。在LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型中，殼寡糖可上調HO-1蛋白表達；HO-1抑制劑鋅原卟啉（ZnPP）可部分逆轉殼寡糖對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞炎癥反應的抑制作用[8]。瓊脂寡糖和殼寡糖能上調HO-1蛋白表達，間接抑制促炎介質的產生，防止炎癥的惡化。

2.1.3 對其他炎性介質的影響 環氧化酶（Cyclooxygenase，COX）、誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、前列腺素（Prostaglandins，PGs）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）都與氧化應激的機制有關，在炎癥反應過程中也起到重要作用。COX是將花生四烯酸代謝為前列腺素家族的炎癥介質，有COX-1和COX-2兩種亞型。海藻酸低聚糖可通過降低NO和PGE2的生成，下調iNOS和COX-2 mRNA及蛋白表達，從而抑制LPS和β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）誘導的BV2小膠質細胞神經炎癥[17]。魔芋寡糖可以改善2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的潰瘍性結腸炎大鼠的體重，降低結腸組織中MDA、iNOS和COX-2水平[13]。Wang等[7]研究發現在LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型中，新瓊脂低聚糖能抑制iNOS的mRNA表達。低聚糖能降低COX-2、iNOS、PGE2和MDA等促炎介質水平，減輕炎癥。

2.2 對炎癥信號通路的影響

2.2.1 對NF-κB信號通路的影響 核轉錄因子-κB（NF-κB）是細胞中重要的轉錄調節因子，NF-κB信號通路廣泛參與機體的非特異性免疫過程和炎癥反應，激活該通路可激活免疫分子的表達，參與炎癥反應的調節過程[55]。Wang等[7]發現在LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型中，新瓊脂低聚糖能顯著下調NF-κB p65和IKK蛋白表達。Huang等[12]研究發現日糧添加殼寡糖后可明顯緩解LPS誘導的仔豬腸道損傷，下調小腸組織中p-NF-κB p65、IKKα/β和IκB蛋白表達。Chu等[14]研究發現在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，低聚半乳糖能降低結腸組織中IL-6、IL-18、IL-13和IL-33分泌及其mRNA表達，抑制結腸中p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達。綜上，新瓊脂低聚糖、殼寡糖、低聚半乳糖能通過抑制NF-κB信號通路從而發揮抗炎作用。

2.2.2 對MAPK信號通路的影響 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是炎癥的另一條重要信號通路，MAPK家族成員包括有胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和絲裂原活化蛋白激酶（p38）三條途徑[56]。在LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型中，殼寡糖能誘導NF-E2相關因子2（Nrf2）的核轉位及上調HO-1、ERK1/2、JNK和p38MAPK蛋白表達；而ERK1/2、JNK和p38的特異性抑制劑可抑制Nrf2核轉位及下調HO-1蛋白表達，表明殼寡糖可能通過Nrf2/MAPK信號通路介導HO-1蛋白表達發揮抗炎作用[8]。在LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型中，新瓊脂低聚糖能下調p38MAPK、ERK1/2、JNK蛋白表達，表明其通過抑制MAPK和Ras/MEK/ERK信號通路發揮抗炎作用[7]。Yeh等[6]研究發現在D-半乳糖誘導大鼠衰老模型中，低聚果糖能下調Jun、JNK蛋白表達，表明低聚果糖可能通過抑制JNK/Jun通路的激活而改善衰老大鼠肺組織炎癥和纖維化。Lim等[16]研究發現木二糖能下調2型糖尿病小鼠肝臟組織p-SAPK/JNK、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表達，改善肝臟的胰島素抵抗，提示木二糖的作用機制與抑制肝臟中MAPK信號通路有關。綜上，殼寡糖、新瓊脂寡糖、低聚果糖可能通過下調ERK1/2、JNK和p38蛋白表達，抑制MAPK信號通路的激活，從而發揮抗炎作用。

2.2.3 對PI3K/Akt信號通路的影響 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶（PI3K/Akt）是細胞內信號轉導通路，參與細胞的生長、增殖和凋亡等活動，與癌癥相關的炎癥性疾病密切相關。Liu等[9]研究發現在LPS誘導人臍靜脈內皮細胞體外炎癥模型中，殼寡糖可下調激活蛋白-1（Activator protein-1，AP-1）、NF-κB、p38MAPK和Akt蛋白表達，而p38MAPK或PI3K抑制劑可逆轉炎癥細胞中IL-8 mRNA的過度表達，表明殼寡糖可能通過抑制MAPK和PI3K/Akt信號通路緩解細胞炎癥反應。劉美思[57]研究發現殼寡糖能抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞異常增殖，下調p-Akt和p-PI3K蛋白表達水平，提示殼寡糖通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而減輕LPS所致巨噬細胞炎癥損傷。

3 前景及展望

研究發現，海藻酸低聚糖對LPS和Aβ誘導的BV2小膠質細胞神經炎癥反應有抑制作用，是一種潛在的治療阿爾茲海默癥或其他神經退行性疾病的營養制劑。低聚果糖可以改善生物合成障礙，從而延緩非酒精性脂肪性肝炎的發生，可作為一種潛在的用于防治非酒精性脂肪肝的膳食配料。低聚殼聚糖對體外細胞炎性損傷模型有明顯的干預作用，而且低聚殼聚糖、低聚甘露糖和低聚半乳糖均能改善急性結腸炎小鼠的臨床癥狀。上述低聚糖在抑制炎癥反應方面具有較大的開發潛力。

低聚糖是一種新型功能性糖源，廣泛應用于食品、保健品、畜牧業和醫藥等領域。低聚糖因具有雙歧因子的功能，可作為益生元而調節腸道菌群，因其具有抗菌活性可作為天然食品保鮮劑，其抗炎、抗癌等生理活性也得到廣泛的認可。但目前低聚糖的應用還存在一定瓶頸：低聚糖缺乏標準化的制備方法和檢測方法，難以大規模生產高純度、低成本、聚合度穩定的低聚糖產品；低聚糖普遍具有還原性和吸水性，較易吸潮，難以長期穩定儲存；低聚糖的抗炎機制研究還不夠深入。隨著人們對低聚糖抗炎機制的深入研究，將為篩選出高效無毒的低聚糖抗炎藥物提供依據。