多糖指紋圖譜分析及譜效關(guān)系研究進展

劉 靜，唐慶九，張勁松，馮 杰，劉艷芳,

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201403；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

多糖是生物體中廣泛存在的生物大分子，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類并稱為生命四大基礎(chǔ)物質(zhì)，對維持機體正常的生命活動起著至關(guān)重要的作用。然而鑒于多糖種類結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使得其研究的深度遠不及蛋白質(zhì)和核酸。目前已有大量研究表明多糖具有抗腫瘤[1-3]、降血糖[4-5]、免疫調(diào)節(jié)[6-7]等功效。多糖作為一種活性大分子，其生物活性與它的單糖組成[8]、分子構(gòu)型[9]、分子量[10]及化學(xué)修飾[11]（如：硫酸化）等密切相關(guān)。然而在傳統(tǒng)的多糖質(zhì)量控制中，多以苯酚-硫酸法檢測的總糖含量作為其評價指標，顯然這種評價方法存在很大的局限性，既不能表征多糖的單糖組成與結(jié)構(gòu)，也不能實現(xiàn)活性多糖的準確定量。因此，建立一種簡單、有效、全面的多糖質(zhì)量評價體系十分重要。

中藥指紋圖譜[12-13]是目前國際公認的中藥質(zhì)控方法，同時為了明確中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，相關(guān)學(xué)者提出了譜效關(guān)系這一新理論[14]，從而實現(xiàn)中草藥的內(nèi)在品質(zhì)評價。隨著多糖質(zhì)控技術(shù)的發(fā)展，多糖指紋圖譜成為多糖質(zhì)量評價的有效手段，近年來已經(jīng)用于中藥多糖、食用菌多糖的圖譜特征分析。此外，依據(jù)其采用的分析技術(shù)不同可分為光譜指紋圖譜和色譜指紋圖譜，其中光譜指紋圖譜的分析技術(shù)包括紅外光譜法和核磁共振譜法；而色譜指紋圖譜技術(shù)則有高效薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、凝膠電泳法、高效陰離子色譜法以及高效分子排阻色譜法。本文對近年來基于光譜、色譜技術(shù)的多糖指紋圖譜和譜效關(guān)系相關(guān)研究進行了綜述，旨在為多糖的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 光譜指紋圖譜

光譜圖一般反映的是化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)信息，有較強的定性功能，此法具有樣品用量少、快速簡便、破壞性小等優(yōu)勢，但定量的準確性較差，因此其常作為色譜指紋圖譜的補充，而非單獨地用其進行多糖的質(zhì)量分析。在多糖的分析研究中，常用的光譜指紋圖譜技術(shù)包括紅外光譜和核磁共振譜。

1.1 紅外光譜

紅外光譜是一種能夠表征化合物官能團特性的分析技術(shù)[15]，其在多糖的結(jié)構(gòu)分析中主要用于判斷糖苷鍵的構(gòu)型。紅外光譜具有操作簡便、特征性強、高效環(huán)保、無損檢測等特點[16]，可以作為多糖檢測分析的輔助手段，但對于組分復(fù)雜的混合物來說，鑒別專屬性差，分辨率低[17]，且所得的圖譜峰常存在重疊現(xiàn)象。

李平凡等[18]通過紅外光譜檢測了10批江西決明子多糖，對所得的11個共有吸收峰的數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果表明未知決明子多糖聚為一類，而不同批次的江西決明子多糖則聚為另一類，從而基于多糖組分實現(xiàn)了江西決明子的質(zhì)量控制。高新開等[19]同時運用紅外光譜和高效液相色譜對不同批次的多糖口服液進行比較，利用相似度方法分析高效液相色譜的圖譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)樣品間無顯著差異，而通過主成分分析和聚類分析對紅外光譜進行研究，發(fā)現(xiàn)樣品KFY16與其它樣品區(qū)分明顯，該結(jié)果表明通過紅外光譜的吸收峰，輔助主成分分析和聚類分析能夠快速地檢測出異常樣品。Li等[20]通過建立傅里葉變換紅外指紋圖譜來表征18批不同來源的草珊瑚多糖的結(jié)構(gòu)信息，主成分分析結(jié)果表明圖譜中的3371 cm-1（羥基基團的伸縮振動）和1411 cm-1（糖分子中羰基基團的伸縮振動）處的吸收峰對于多糖樣品的產(chǎn)地鑒別貢獻較大，該方法為草珊瑚多糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了有效的方法。紅外光譜作為一種綜合的結(jié)構(gòu)鑒定手段，已經(jīng)在多糖指紋圖譜研究中得到較為廣泛的應(yīng)用，同時結(jié)合不同的化學(xué)計量學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的快速鑒別。

1.2 核磁共振圖譜

核磁共振可提供多糖單糖類別和糖苷鍵構(gòu)型等豐富的結(jié)構(gòu)信息，其圖譜中的信號強弱大致能反映混合物中各組分的相對含量，而圖譜中的化學(xué)位移則可用于定性分析，其具有不破壞樣品的形態(tài)、分析快速、無選擇性等優(yōu)點，但對樣品的純度要求較高。與紅外光譜相比，核磁共振圖譜反映的信息更多，重現(xiàn)性更好[21]。其多糖指紋圖譜的研究主要集中在核磁共振氫譜和碳譜分析兩個方面，目前已經(jīng)初步地應(yīng)用于不同產(chǎn)地多糖的鑒別。

趙璇等[22]采用核磁共振技術(shù)對比研究了南、北葶藶子的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)南葶藶子比北葶藶子的質(zhì)子峰更密且雜，揭示了兩者在多糖組分方面的差異，為葶藶子的來源區(qū)分提供了有效的手段。陳艷蕊[23]以黃芪多糖為研究對象，建立了不同產(chǎn)地黃芪多糖的核磁共振氫譜，直觀上可以看出不同產(chǎn)地黃芪圖譜中糖質(zhì)子峰的個數(shù)和高度均不同，表明不同產(chǎn)地黃芪多糖的糖殘基種類和連接方式存在一定的差異，可作為黃芪產(chǎn)地區(qū)分的輔助手段。為了從大量的數(shù)據(jù)中篩選出更有效的信息，Li等[24]比較分析內(nèi)蒙古和甘肅兩個產(chǎn)地黃芪多糖的核磁共振氫譜，結(jié)合主成分分析比較各樣品之間的差異，結(jié)果表明圖譜中半乳糖和β-葡萄糖的異頭質(zhì)子信號對黃芪產(chǎn)地鑒別的貢獻較大，為后續(xù)黃芪的質(zhì)量控制提供一種新方法。核磁共振技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的無損檢測技術(shù)，它具有樣品可回收、前處理步驟少等優(yōu)勢，但是對于組分復(fù)雜的化合物，其圖譜信號重疊難以辨析，因此多糖在制備過程中需要經(jīng)過脫脂、醇沉、脫蛋白等純化處理，盡量減少雜質(zhì)對圖譜的干擾。

2 色譜指紋圖譜

多糖色譜指紋圖譜的研究主要針對分子量分布特征分析和水解產(chǎn)物分析兩方面，其中水解產(chǎn)物分析又分為單糖組成分析和寡糖片段分析，相關(guān)研究見表1。目前用于多糖分子量分布檢測的是高效分子排阻色譜法，單糖組成分析的方法主要包括高效液相色譜、氣相色譜及高效陰離子交換色譜，而寡糖片段分析的研究手段主要有高效薄層色譜、凝膠電泳、親水作用色譜、高效陰離子交換色譜以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。

表1 色譜指紋圖譜在多糖中的應(yīng)用Table 1 Applications of chromatographic fingerprinting techniques on polysaccharides

2.1 多糖的分子量分布特征分析

多糖生物活性與其分子量分布密切相關(guān)，因此很有必要建立多糖分子量分布的指紋圖譜。高效分子排阻色譜法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）是分析天然產(chǎn)物中聚合物分子量和分子量分布最常用的技術(shù)之一，常用于檢測多糖及其水解產(chǎn)物的分子量分布[25-26]，目前已廣泛應(yīng)用于多糖分子量的檢測。

吳定濤等[27]采用色譜柱TSK Gel G6000pwxl和TSK Gel G3000pwxl串聯(lián)，比較分析不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖的分子量分布，通過確定特征色譜峰比較其圖譜的相似度發(fā)現(xiàn)各樣品間的指紋圖譜重合度較好，均含有3個相似的特征色譜峰，表明不同產(chǎn)地的竹蓀多糖質(zhì)量較一致。Xu等[28]運用HPSEC技術(shù)建立了石斛多糖的指紋圖譜，結(jié)果表明不同批次的鐵皮石斛多糖圖譜一致性良好，但鐵皮石斛與其它品種的石斛分子量分布圖譜差異顯著，后者主要表現(xiàn)為大分子量多糖色譜峰的缺失。Li等[29]對不同批次的滋腎育胎丸中的多糖進行了分子量分布的特征分析，明確指出分子量Mw≥2.10×105Da可以作為控制該中成藥多糖的質(zhì)量參數(shù)，說明高效分子排阻色譜指紋圖譜可作為滋腎育胎丸多糖的質(zhì)量控制手段。Guan等[30]依據(jù)多糖對不同糖苷酶的響應(yīng)特性建立了9種中草藥多糖的分子量指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同中藥多糖酶解后的分子量圖譜存在明顯差異，并通過木糖酶和1,4-半乳糖酶可實現(xiàn)不同種屬人參多糖的鑒別。由此可見，HPSEC是一種高效、簡便的多糖指紋圖譜構(gòu)建方法，可以較好地反映不同材料中多糖的分子量分布特征。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，HPSEC與多角度激光光散射檢測器和示差折光檢測器[31]聯(lián)用的分析系統(tǒng)逐漸用于多糖分子量的檢測，與傳統(tǒng)的HPSEC聯(lián)用示差檢測器或蒸發(fā)光檢測器比較，它不僅不需要多糖標準品，而且能同時測定多糖分子量及其含量，故該技術(shù)的應(yīng)用有助于提高多糖分子量指紋圖譜的準確性。

2.2 多糖的水解產(chǎn)物分析

天然來源的多糖是一類理化性質(zhì)極其相似的大分子混合物，具有復(fù)雜的組分和結(jié)構(gòu)。為了對多糖化合物進行有效的分離和分析，在進行多糖圖譜分析之前，常常需要將多糖水解成寡糖或者單糖，然后選擇合適的分析方法檢測水解產(chǎn)物。目前常用于多糖的水解方法是酸解法和酶解法，其中酸水解又包括完全酸水解和部分酸水解。

2.2.1 單糖組成分析 常用于單糖組成檢測的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法以及高效陰離子交換色譜，通過對多糖的完全水解產(chǎn)物進行分析可明確其單糖種類及含量。目前不同的分析技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于靈芝多糖、枸杞多糖、茶多糖、黃芪多糖等單糖組成指紋圖譜的研究。

2.2.1.1 高效液相色譜 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是構(gòu)建單糖指紋圖譜最常用的方法，在糖譜分析中應(yīng)用較多，其最大的優(yōu)勢是可以與不同的檢測器聯(lián)用，從而滿足不同樣品的測定需求。Liu等[32]將提取的枸杞多糖完全酸水解后再進行HPLC分析，研究表明不同產(chǎn)地的枸杞子多糖均由9種單糖構(gòu)成但各單糖所占摩爾比例不同，能夠有效地區(qū)分不同產(chǎn)地的枸杞子。Liu等[33]通過HPLC技術(shù)建立了不同產(chǎn)地的茯苓多糖和豬苓多糖的單糖組成指紋圖譜，對比標準圖譜發(fā)現(xiàn)茯苓樣品只有5種單糖，而豬苓樣品含有8種單糖。同時主成分分析結(jié)果表明茯苓和豬苓多糖可以區(qū)分為兩類，并且發(fā)現(xiàn)核糖和甘露糖可以作為區(qū)分兩者的主要指標。

2.2.1.2 氣相色譜 氣相色譜（gas chromatography，GC）是一種主要用于表征和鑒定揮發(fā)性化合物的分析技術(shù)，是測定多糖單糖組成的一種有效而靈敏的方法[34]。GC具有靈敏度高、分離度好、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)勢[35]。郝霞[36]以細胞壁多糖為研究對象，通過氣相色譜技術(shù)建立不同種屬和不同生長方式的黃芪細胞壁多糖的單糖指紋圖譜，采用多元統(tǒng)計學(xué)對數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種屬的黃芪區(qū)分不明顯，而速生黃芪和傳統(tǒng)黃芪明顯分成兩部分，該研究為鑒別速生黃芪和傳統(tǒng)黃芪提供了科學(xué)依據(jù)。Cheong等[37]采用氣相色譜比較分析了人參、西洋參和三七3種人參屬植物多糖的單糖組成，發(fā)現(xiàn)它們均由6種單糖組成，但是各單糖色譜峰的強度存在差異，該結(jié)果對人參屬植物特有多糖的鑒定具有一定的參考價值。

2.2.1.3 高效陰離子交換色譜 高效陰離子交換色譜（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）廣泛應(yīng)用于單糖和大部分的寡糖的檢測[38-39]，它常與脈沖安培檢測器（PAD）連用，形成高特異性、高靈敏度、高分辨率的檢測方法。它不僅不需要衍生化，同時對于不同糖組分（如差向異構(gòu)體）的分離效果更好，靈敏度也有所提升。Wang等[40]采用HPAEC系統(tǒng)分析了22批茶多糖和5批其他多糖的單糖組成，離子指紋圖譜表明22個茶多糖樣品的單糖組成相似但是比例不同，而茶多糖與非茶多糖圖譜的差異性較大，因此可以通過離子色譜鑒別茶多糖樣品的真?zhèn)巍Ｚw丹等[41]探究了不同產(chǎn)地葛根多糖完全水解產(chǎn)物中的單糖組成及其含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品中均含有巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖，而只有個別樣品中含有甘露糖、木糖和核糖，另外發(fā)現(xiàn)有3個葛根樣品不含半乳糖，該方法為葛根多糖的質(zhì)量控制提供新方法。

上述研究表明，HPLC、GC以及HPAEC均可用于單糖組成分析，并且根據(jù)多糖完全水解產(chǎn)物的單糖種類和比例等圖譜特征實現(xiàn)植物多糖產(chǎn)地和種屬的鑒別。相比較而言，HPLC需要對水解產(chǎn)物進行衍生化處理，或者聯(lián)用靈敏度較低的示差和蒸發(fā)光散射檢測器；GC同樣需要對水解產(chǎn)物進行衍生化，對多種單糖可以實現(xiàn)較好分離，但該技術(shù)不適用于糖醛酸組分的檢測；高效陰離子交換色譜（HPAEC）連用脈沖電化學(xué)檢測技術(shù)無需衍生化就可以直接分析水解產(chǎn)物，且對于各單糖和糖醛酸組分均可實現(xiàn)較好的分離和檢測，目前HPAEC-PAD是構(gòu)建單糖組成指紋圖譜較為理想的技術(shù)。

2.2.2 寡糖或低聚糖片段分析

2.2.2.1 高效薄層色譜法 高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography，HPTLC）是寡糖組分分析的常規(guī)方法，既可用于定性分析也可用于定量分析。HPTLC具有直觀性強、溶劑消耗量少、成本低、操作簡便等優(yōu)點。但HPTLC極易受到實驗人員的操作技術(shù)和環(huán)境的影響，因此其重復(fù)性差，同時不適用聚合度較高的寡糖[42]（DP＞15）分離。Wu等[43]采用高效薄層色譜法比較研究蟲草和其混偽品多糖的酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)混偽品水解得到的寡糖片段的豐富度明顯低于蟲草正品，這為蛹蟲草的合理使用提供依據(jù)。Deng等[44]通過HPTLC技術(shù)構(gòu)建不同產(chǎn)地太子參多糖酶解后的寡糖指紋圖譜，通過定量和定性分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的太子參寡糖指紋圖譜較為相似（相似度值高達0.878），說明不同產(chǎn)地太子參多糖具有較好的一致性，為太子參的質(zhì)量控制提供新方法。王桂臻[45]基于HPTLC技術(shù)對黃芪多糖部分酸水解的寡糖產(chǎn)物進行表征，采用偏最小二乘法分析圖譜的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)區(qū)分黃芪栽培方式的寡糖片段為三糖和四糖，而二糖和三糖則為辨別黃芪種屬的片段，且栽培方式的差異要大于種間差異。HPTLC技術(shù)可以作為一種有效的鑒別方法，但相關(guān)研究表明HPTLC僅對于聚合度較低（DP≤5）寡糖分離效果較為理想，因此通常需要聯(lián)用其它的技術(shù)才能實現(xiàn)對寡糖片段的全面分析。

2.2.2.2 凝膠電泳 凝膠電泳（polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis，PACE）是利用分子本身不同的遷移速率及凝膠的分子篩作用而達到分離的目的。它具有較高的分辨率（可以分離聚合度為40的低聚糖）和良好的靈敏度[46-47]。PACE是一種經(jīng)濟、簡單、高靈敏和高分辨率的寡糖分析技術(shù)。它不需要流動相或者展開劑以及大型的儀器設(shè)備，并且其定量的準確性較HPTLC有明顯地改善，但需要ANTS衍生化，重復(fù)性差。

Wu等[48]以猴頭菇多糖為研究對象，采用熒光輔助糖電泳技術(shù)構(gòu)建了多糖酶解產(chǎn)物的PACE指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)猴頭菇子實體多糖均可被選定的5種酶水解產(chǎn)生寡糖片段，而市售的猴頭菇多糖不能被其中的2種酶所降解，因此兩者的低聚糖圖譜有明顯差異，該方法有利于提高猴頭菇多糖的質(zhì)量控制水平。為了探究不同品種靈芝多糖的特征，Wu等[49]采用部分酸水解結(jié)合凝膠電泳（PACE）對紫芝、赤芝及其混偽品的降解產(chǎn)物進行比較分析，發(fā)現(xiàn)紫芝和赤芝多糖的PACE圖譜極其相似，但兩者與其他種屬靈芝（混偽品）的指紋圖譜明顯不同，該研究對靈芝多糖的質(zhì)量控制有一定的參考價值。王迪等[50]用內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶處理蒙古黃芪多糖和膜莢黃芪多糖，通過對比分析酶解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜得到區(qū)分不同黃芪種屬的差異性寡糖片段（五糖和六糖），有助于實現(xiàn)黃芪品種的區(qū)分。基于PACE分析的指紋圖譜被證明是一種可行的方法，與HPTLC相比，它能夠提供更多的低聚糖條帶信息，然而對于單糖的分辨率不高，因此其可以和HPTLC技術(shù)結(jié)合使用。

2.2.2.3 親水作用色譜法 親水作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是分離極性和親水性化合物的液相色譜。它是由學(xué)者Alpert[51]提出的，并逐漸被廣大學(xué)者認可和應(yīng)用。而多糖作為一種親水性的化合物，可以很好地被親水作用色譜柱分離測定，尤其在寡糖[52-53]分析方面已經(jīng)取得了一些成果。

梁琰[54]采用部分酸解法降解靈芝多糖，并構(gòu)建其HILIC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同品種靈芝多糖的HILIC圖譜中均含有相同的10個糖組分（單糖和寡糖），但是其中的一些糖組分的含量差異較大，可以作為區(qū)分靈芝品種的有效手段。Xia等[55]通過親水作用色譜聯(lián)用蒸發(fā)光檢測器技術(shù)分別對膜莢黃芪多糖和蒙古黃芪多糖的部分酸水解產(chǎn)物進行了分離和檢測，結(jié)果顯示不同品種黃芪特征指紋圖譜均含有聚合度2-11的寡糖組分，但是各組分的含量有差異，說明該技術(shù)可用于黃芪品種的鑒別。Wang等[56]同樣采用HILIC-ELSD技術(shù)對酸降解的寡糖進行分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的膜莢黃芪之間存在差異，為黃芪產(chǎn)地的區(qū)分提供參考。綜上所述，通過HILIC結(jié)合ELSD能夠?qū)烟沁M行較好的分離和檢測，為低聚糖的檢測提供了有效的方法。

2.2.2.4 高效陰離子交換色譜法 高效陰離子交換色譜法（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）聯(lián)合脈沖安培檢測器可對多糖的水解片段直接進行分析，樣品不需要衍生化，在相關(guān)領(lǐng)域已有較多應(yīng)用。但是該方法無法準確地反映寡糖或低聚糖的聚合度信息，需要串聯(lián)質(zhì)譜初步判斷寡糖組分的聚合度。丁平等[57]通過高效陰離子交換色譜-脈沖安培電化學(xué)檢測器（HPAEC-PAD）分析巴戟天及其常見混偽品的寡糖成分，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的巴戟天HPAEC圖譜中均含有20種糖成分，但是各組分含量存在一定的差異；同時對比分析了巴戟天及其常見混偽品，結(jié)果顯示常見的混偽品中含有的寡糖種類較少甚至沒有，為鑒別巴戟天真?zhèn)翁峁┯行У姆椒āＭ鹾坪繹58]構(gòu)建了20批靈芝孢子粉多糖樣品酸-酶水解物寡糖組分的HPAEC標準指紋圖譜，并在寡糖圖譜中確定了5個共有特征峰，通過與菊粉對照品進行對比分析發(fā)現(xiàn)它們分別為三糖、五糖、六糖、七糖和多糖，該圖譜為靈芝孢子粉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。Liu等[59]應(yīng)用HPAEC-PAD來表征兩種不同來源的海帶多糖的酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)來自褐藻的海帶多糖酶解后得到的低聚糖片段更加復(fù)雜（12個產(chǎn)物峰），同時發(fā)現(xiàn)各色譜峰所占的比例也有較大的差異，表明通過HPAEC技術(shù)辨別海帶多糖具有一定的可行性。

2.2.2.5 液質(zhì)聯(lián)用 液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)充分地將液相的高分離效能與質(zhì)譜的強大定性能力結(jié)合[60]。其最大的特點是應(yīng)用質(zhì)譜提供的結(jié)構(gòu)信息來推測未知化合物的結(jié)構(gòu)，即使在沒有標準品的情況下也可以實現(xiàn)對化學(xué)成分的定性分析。廖俊昭等[61]采用高效液相色譜-電噴霧電離高分辨飛行時間質(zhì)譜建立了人參多糖酸解產(chǎn)物的指紋圖譜，研究發(fā)現(xiàn)不同糖苷鍵的二糖質(zhì)譜圖具有不同的斷裂規(guī)律，在相同的色譜條件下建立了人參多糖的糖譜，經(jīng)過對比分析后發(fā)現(xiàn)人參二糖中含有1,3糖苷鍵和1,4糖苷鍵，該方法為人參多糖結(jié)構(gòu)的分析提供新思路。Eshani等[62]運用氧化法降解標準多糖和食品原液，并通過HPLC-QTOF-MS技術(shù)構(gòu)建不同食品原料的寡糖指紋圖譜，通過與標準多糖的寡糖圖譜進行匹配發(fā)現(xiàn)椰子果肉主要由甘露聚糖和半乳甘露聚糖組成，而黃玉米粉主要由直鏈淀粉組成，該研究建立了一種基于多糖降解和多糖標準品產(chǎn)生的寡糖指紋圖譜來確定食品中多糖組成的方法。LC-MS作為一種分析糖類化合物的新型技術(shù)，不僅可以直接分析降解產(chǎn)物，而且還能夠較為準確地表征水解產(chǎn)物中寡糖的聚合度，是研究多糖結(jié)構(gòu)的有效手段。

3 譜效關(guān)系的研究

譜效關(guān)系被認為是一種潛在的有效的中藥內(nèi)在質(zhì)量控制方法，它在中藥領(lǐng)域已經(jīng)得到了較廣泛的應(yīng)用，但是關(guān)于多糖的譜效關(guān)系研究較少。目前多糖譜效關(guān)系的研究處于初級階段，其主要集中在單糖組成分析和多糖分子量檢測兩個方面[63-64]，如表2所示。因此，本部分主要總結(jié)多糖的譜效研究成果，以期為多糖譜效關(guān)系的研究提供思路。譜效關(guān)系的研究思路[65]（如圖1）大致可以分為三部分，第一部分：選擇合適的分析方法構(gòu)建所測樣品的指紋圖譜，同時通過體內(nèi)和體外實驗獲得藥效學(xué)數(shù)據(jù)；第二部分：將色譜指紋圖譜的信息與所得的藥效學(xué)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，從而建立相應(yīng)的譜效關(guān)系模型；第三部分：明確發(fā)揮藥理活性的有效成分，并通過查閱相關(guān)資料確定有效成分的結(jié)構(gòu)。目前應(yīng)用于譜效關(guān)系研究的數(shù)據(jù)處理方法[66]主要有灰色關(guān)聯(lián)度分析法[67]、偏最小二乘回歸分析法[68]、主成分分析法[69]等，每種數(shù)據(jù)分析的方法都存在優(yōu)勢和不足之處。

圖1 多糖譜效關(guān)系研究思路Fig.1 Research ideas on profile-effect relationship of polysaccharide

表2 多糖的譜效研究Table 2 Research on profile-effect relationship of polysaccharide

劉小花等[70]采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法將10批黃芪藥材水部位的HPLC指紋圖譜的峰面積和吞噬指數(shù)數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示圖譜中的7組共有峰都與免疫力的提高有一定的關(guān)聯(lián)度，推測可能是黃芪水部位的黃芪多糖為藥效物質(zhì)。張培等[71]探究了不同產(chǎn)地黨參多糖的單糖組成與其抗病毒活性的關(guān)系，偏最小二乘法結(jié)果表明黨參多糖的單糖種類與其對HepG2細胞的抑制率存在一定的關(guān)聯(lián)性。

孫杰[72]構(gòu)建了不同部位蓮藕多糖與其抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性的譜效模型，研究表明多糖中的各單糖成分（除Glc外）均與其活性呈現(xiàn)一定的正/負相關(guān)性，而與其分子量無關(guān)。Dong等[73]采用多元線性回歸分析法研究了金針菇多糖的單糖組成與腫瘤細胞活性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘露糖與癌細胞抑制率呈正相關(guān)，而木糖、半乳糖、鼠李糖則與抑制率呈負相關(guān)。通過對譜效關(guān)系的研究，建立了一種有效評估金針菇多糖活性的方法。肖穎等[74]運用HPLC技術(shù)建立了16批不同產(chǎn)地的茯苓多糖的指紋圖譜，并測定其體外免疫活性，聯(lián)合偏最小二乘回歸分析法篩選出影響多糖活性的正負相關(guān)峰，發(fā)現(xiàn)其中的葡萄糖、半乳糖和甘露糖顯著地影響茯苓多糖的免疫活性，該研究為茯苓多糖譜效關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)。

上述研究可以看出當前多糖的譜效研究深度不夠，其主要表現(xiàn)為指紋圖譜構(gòu)建的技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法較為單一，不能多維度地對其進行分析。譜效關(guān)系研究成為近年來的研究熱點，尤其在中藥譜效研究領(lǐng)域已經(jīng)取得一定成果，但目前針對多糖譜效關(guān)系的研究比較薄弱，故今后可以借鑒中藥譜效關(guān)系的相關(guān)研究，進一步推動多糖譜效關(guān)系的發(fā)展。

4 總結(jié)與展望

多糖的質(zhì)量控制一直是多糖及其產(chǎn)品商業(yè)化的關(guān)鍵問題。指紋圖譜技術(shù)是多組分質(zhì)量控制的有力工具，同時結(jié)合多糖的藥效學(xué)研究篩選出活性成分，從而控制多糖的內(nèi)在品質(zhì)。目前多糖指紋圖譜的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但其研究仍處于初級階段，今后可針對以下幾方面開展深入研究：a.加強對酶解產(chǎn)物特征片段的分析，建立特異性的多糖酶解指紋圖譜，實現(xiàn)不同來源多糖的鑒別；b.聯(lián)用多種分析技術(shù)建立多糖的多維指紋圖譜，從而更加全面準確地反映多糖的結(jié)構(gòu)特征；c.探究多糖的糖苷鍵類型、高級構(gòu)象等與其生物活性的相關(guān)性，擴展多糖譜效關(guān)系的研究思路；d.在數(shù)據(jù)處理方面，結(jié)合多種數(shù)據(jù)分析技術(shù)，從而更加全面精確地分析譜效信息。因此，隨著儀器分析技術(shù)、藥效學(xué)評價體系及數(shù)據(jù)分析方法的更新和完善，將進一步推動多糖指紋圖譜及其譜效研究的發(fā)展，為多糖的質(zhì)控開創(chuàng)一個準確、快速、高通量的評價策略。