基于網絡藥理學和分子對接研究雞血藤抗骨質疏松的藥效物質及作用機制

呂經緯，李春楠，李 光，張楠茜，張凱月，邊學峰，張 輝, ，孫佳明,

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春 130117；2.長春中醫藥大學醫藥信息學院，吉林長春 130117）

隨著人口老齡化發展，骨質疏松癥（osteoporosis，OP）已成為世界上第七大常見疾病[1]，給醫療和社會造成嚴重的負擔[2]。研究表明骨質疏松的發生發展和飲食息息相關[3]，采用藥膳食療法改善骨質疏松癥越來越受到認可。Tseng等報道異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質疏松等作用[4-5]，異黃酮可提高骨密度，提高血清骨形成指標水平，促進骨質疏松大鼠骨形成[6]。作為純天然的植物提取物，異黃酮具有活性好、安全性高、來源廣泛、毒性低等特點，在藥品、保健品、功能食品及化妝品行業具有重要的用途[7]。

雞血藤為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectusDunn）的干燥莖藤，主要來源于廣東、廣西等省，被廣泛用作茶、酒和湯的食品添加劑[8]，具有行血補血、通經活絡、強壯筋骨之功效[9]，在傳統醫學治療骨質疏松中有著悠久的歷史[10]。研究表明，雞血藤中含有大量的異黃酮[11]，具有促進成骨細胞合成和分泌堿性磷酸酶的作用[12]，其提取物對胎鼠尺骨和撓骨的生長有促進作用[13]。曹輝等[14]報道以雞血藤為君藥的藤黃健骨膠囊具有治療骨質疏松的作用，能夠抑制骨質吸收、促進成骨細胞形成和骨的重建。但雞血藤治療骨質疏松癥的機制尚不明確，因此，研究雞血藤活性成分治療骨質疏松的分子機制具有重要意義。以往的研究表明，植物來源有效成分中大多數研究集中在單一成分與抗骨質疏松活性的關系上，而揭示天然產物與細胞蛋白之間復雜的相互作用以及對人體功能的影響未見報道。本研究基于網絡藥理學構建“成分-靶點-通路”網絡模型，并應用分子對接驗證分析，篩選出雞血藤抗骨質疏松的有效成分與關鍵靶點，為尋找植物來源的天然化合物抗骨質疏松的保健食品開發提供快速、高效篩選的方法參考。

1 資料與方法

1.1 數據準備

從TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫和文獻[15-20]中收集雞血藤14個有效成分的化學結構信息，包括黃酮類和酚酸類（見表1），所有化合物均從NCBI PubChem數據庫（http://www.NCBI.nlm.nih.gov/pccompound/）下載并保存為sdf格式文件，提交至PharmMapper數據庫，參數和最大生成構象分別設置為ON和300，在高級選項中選擇“僅人類蛋白質靶點（v2010，2241）”，其他選項設為默認值[21-24]，采用統計方法和反向對接技術來識別化合物的潛在靶點，最后選擇z’-score＞1[25]的匹配靶點進行綜合網絡藥理學分析。

1.2 網絡構建和拓撲分析

將PharmMapper數據庫篩選出的靶點去重后，通過使用檢索/ID映射（http://www.uniprot.org/uploadlists/）將靶點轉換為UniProtKB標識符用于以下網絡構建和拓撲分析。通過Cytoscape 3.7.2軟件[26]構建14個化合物與PharmMapper靶點相互作用網絡，可視化分析之間存在的聯系，并對成分-靶點網絡進行GO生物學注釋和KEGG富集分析，以確定雞血藤抗骨質疏松作用的關鍵通路。Clue GO插件用于分析生物網絡中注釋和功能組之間的相互關系，并對關鍵網絡進行深入的探索。在ClueGO操作界面中，刪除重復節點，將UniprotKB導入智人列表，Go-tree區間為5～10，kappa評分為0.4，P值為0.01，ClueGO結果僅顯示GO生物過程和KEGG信號通路。

為了篩選復雜富集網絡中的關鍵靶點和通路，利用CytoNCA插件計算節點的中心性。CytoNCA提供了8種中心性（介數、接近中心性、自由度、特征向量中心性、平均最短路徑長度、網絡中心性、子網絡中心性和信息中心性），本研究分別選取介數、接近中心性和子網絡中心性的前10%的節點，通過三個中心性的重疊，生成具有關鍵靶點的子網絡。

1.3 分子對接

雖然通過各種生物過程和信號通路中的蛋白質能夠篩選出一些藥物，但是化合物和蛋白質的結合可能較弱。同樣，雞血藤中的一些化合物可能與關鍵蛋白質結合較弱，為了剔除這些蛋白質和化合物，故進行了基于分子對接的虛擬篩選。

利用AutoDock 4.2軟件進行分子對接，研究潛在靶點與化合物的結合能力。將表1中14個化合物的配體分別導入軟件中，與從RCSB蛋白質數據庫（http://www.RCSB.org/pdb/home/home.do）下載KEGG通路中的靶蛋白進行對接，根據相關文獻報道[27-28]，參數設置為：Grid Box坐標（4DMX：-6.875，2.256，10.836），盒子大小為40×40×40個網格點；（4MXO：11.896，-36.649，-6.446），盒子大小為60×40×40個網格點，運行次數為100，其他參數采用軟件的默認設置，采用拉馬克遺傳（Lamarckian genetic algorithm）算法評價配體與受體的結合能。采用Pymol、Ligplus軟件對分子對接結果進行分析與展示。

表1 雞血藤的14個有效成分Table 1 14 active ingredients of Spatholobi Caulis

2 結果與分析

2.1 網絡構建

文章整體架構見圖1。雞血藤14個化合物從PharmMapper數據庫獲得601個靶點，篩重后通過檢索/ID映射（http://www.uniprot.org/uploadlists/）轉換為221個UniProt KB標識符用于以下富集分析。應用Cytoscape 3.7.2軟件構建化合物-靶點網絡，生成的網絡包含235個節點和601條邊，如圖2所示，化合物越大，表明結合的靶點越多，化合JXT-02、JXT-03、JXT-06、JXT-10、JXT-11和JXT-13在網絡中的degree值大于其他化合物，顯示出了更強的多重交互結合靶點作用，主要包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC，UniProtKB：P12931）、組織蛋白酶K（CTSK，UniProtKB：P43235），中性粒細胞膠原酶（MMP8，UniProt KB：P22894）和雌激素受體（分別為ESR1、ESR2、NCOA5，UniProt KB：P03372、Q92731、Q9HCD5），這些蛋白質都參與骨質疏松和代謝反應，該網絡揭示了雞血藤的14個成分對骨質疏松的蛋白質靶點或生物途徑有聯合作用。

圖1 基于網絡藥理學和分子對接的整體框架Fig.1 Overall framework based on network pharmacology and molecular docking

圖2 14個化合物與601個靶點網絡Fig.2 14 compounds and 601 target network

2.2 富集分析

將221個靶點導入ClueGo插件得到靶點生物過程網絡（456個節點和5723條邊）和KEGG信號通路網絡（124個節點和365條邊）（圖3a～3b），選用3個中心性度值篩選核心子網絡（圖3c～3d），在同一顏色組中包含了密切相關的靶點。

中草藥治療疾病的特點具有多成分相互配合、協同增效的作用。研究表明雞血藤不同成分以相互連接的生物網絡中不同節點為目標，這些節點具有相似的功能，而針對這一個相互關聯的生物網絡為目標的治療方式有利于避免旁路激活引起的耐藥性。

在GO生物過程子網絡（包含15個節點和47條邊）中，15個靶點注釋均與大量生物過程顯著相關，包括蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、核苷磷酸代謝過程、核苷酸代謝過程、MAPK級聯反應的正調控、調節蛋白激酶活性、含核堿基的小分子代謝過程和有機磷酸酯的生物合成過程（表2，圖3c）；KEGG信號通路子網絡（包含10個節點和9條邊）包含流體剪切應力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝、嘧啶代謝和藥物代謝等信號通路（表3，圖3d），此外，KEGG信號通路子網絡還揭示了與癌癥的關系。我們發現，由于骨質疏松反應不可避免地伴隨著代謝反應，因此絕大多數靶點本體注釋和KEGG信號通路都與機體代謝系統有關，因此，利用該子網絡來分析雞血藤抗骨質疏松作用的機制是可行的。

表2 生物過程子網絡Table 2 Biological process sub-network

表3 KEGG信號通路子網絡Table 3 KEGG signal path sub-network

在靶點生物過程和KEGG信號通路富集分析的結果中，大量的必需靶點與代謝信號通路或生物過程相關（圖3c～3d），表明雞血藤抗骨質疏松可能與代謝異常有關。

骨質疏松代謝相關的生物過程包含多條信號通路[29]，而流體剪切應力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝等信號通路中的SRC、CTSK等靶點在調控骨質疏松中發揮了至關重要的作用[30-31]。關于骨代謝，SRC在破骨細胞中表達的水平比其他細胞高5～200倍[32]，SRC激酶已被證明可以通過細胞信號傳導和生化調節促進破骨細胞的分化和激活，從而導致骨吸收增加[33]，因此SRC蛋白激酶抑制劑是治療骨質疏松癥的藥物靶點。另外，與破骨細胞相關的CTSK表達上調引起關節周圍骨量下降，尤其是股骨末梢干骺端的骨質流失[34]，因此，抑制組織蛋白酶K表達可以降低骨質流失。以上研究與本網絡藥理學預測的KEGG信號通路富集網絡的結果一致（圖3d中橙色和紫色）。

圖3 雞血藤預測靶點的生物過程網絡Fig.3 Biological process network of the predicted target of Spatholobi Caulis

圖3d中的藍色是葉酸生物合成代謝通路，葉酸在體內存于腸壁、肝、骨髓等組織中，被葉酸還原酶還原成具有生理活性的四氫葉酸并參與嘧啶的合成，對正常紅細胞的形成有促進作用。這與中醫對雞血藤活血作用的描述一致。

在KEGG子網絡中，流體剪切應力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路進一步劃分并置于同一組中（圖3d）。在KEGG信號通路分析的結果中，關鍵靶點SRC是通過流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路直接參與骨代謝發揮的作用（條目：hsa:05418，圖3d中淺紫色），同時，調節蛋白激酶活性生物過程（條目：GO:0045859，圖3c中淺藍色）也出現在靶點富集分析中協同發揮作用。此外，在KEGG富集分析中，細胞色素P450對異生物的代謝信號通路（條目：hsa:00980，圖3d中橙色）也被認為是必不可少的通路，因為該通路中的CTSK對于調節骨吸收至關重要。可以推測雞血藤通過影響上述信號通路調節了骨代謝反應并治療骨質疏松。

綜上所述，抑制破骨細胞的生物過程在骨質疏松和代謝調節中起著至關重要的作用，而流體剪切應力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路是生物過程的關鍵。將KEGG子網絡靶點篩重后，選擇PharmMapper數據庫篩選出的、并富集在上述信號通路中的2個蛋白作為進一步對接研究的靶點：SRC（PDBID：4MXO）和CTSK（PDBID：4DMX）。故提示雞血藤14個化合物通過靶向影響破骨細胞分化成熟的關鍵靶點調控流體剪切應力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路，進而表現出抗骨質疏松作用。

2.3 分子對接

雞血藤14個化合物的對接結果見表4，兩個關鍵靶點（4MXO和4DMX）的平均對接得分為-6.32和-5.47，提示與原配體具有相似的結合能力（-7.67和-6.87）。結果表明，雞血藤14個化合物通過2條KEGG信號通路（流體剪切應力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路）中的2個關鍵靶點協同發揮抗骨質疏松的作用。

采用AutoDock 4.2進行分子對接，根據蛋白質與配體之間相互作用的結合能選擇評分函數，分別得到每個化合物和受體的對接得分，得分越低，配體與受體結合越穩定[35]，結果見表4。為了篩選出能夠與關鍵靶點具有較好結合能力的化合物，對14個化合物與2個靶點的結合能進行了研究。在抗骨質疏松級聯反應中，按照對接分數降序排列，篩選出化合物-靶點復合物。最后，從表4中挑選出與初始配體結合能相近的前2名對接結果，其中櫻黃素（JXT-13）和甘草素（JXT-06）與靶位點SRC和CTSK的結合能力強。研究表明，櫻黃素（JXT-13）可以通過抑制破骨細胞增殖來對骨質疏松小鼠起保護作用[36]；甘草素（JXT-06）能抑制破骨細胞形成和骨吸收活性緩解類風濕性關節炎的骨破壞[37]，說明上述化合物對抗骨質疏松有效。SRC作為流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路中的下游成員，SRC激酶刺激破骨細胞生成并激活，從而導致骨吸收增加，引發骨質疏松形成。因此，選擇復合物JXT-13/4MXO和JXT-06/4DMX（分別為-7.63和-6.31）進行進一步的對接分析研究，以分析抑制劑的結合能力。

表4 雞血藤14個成分與SRC和CTSK靶點結合打分排序表Table 4 Molecular docking results of 14 compounds from Spatholobi Caulis with SRC and CTSK

復合物JXT-13/4MXO和JXT-06/4DMX的配體相互作用分別見圖4b、4d，圖5b、5d。在圖4a、4c中，內置配體是SRC的抑制劑，通過3個氫鍵與處于活化狀態的Abl蛋白的活化環結合，其中兩個氫鍵位于ATP結合位點的鉸鏈區，另一個將內置配體氨基的氮原子與蛋白的Met341氨基酸上羥基的氧原子相連接，從而抑制酪氨酸激酶的活性[27]。在圖4b中可以看到化合物JXT-13的酚基和Glu310、Thr338、Phe405、Glu339和Met341之間存在相互作用的氫鍵。Met341與作為主鏈受體的內置配體嘧啶形成氫原子，與復合物JXT-13/4MXO中的羥基具有相似的相互作用。此外，兩個配體周圍的氨基酸（Met341、Thr338、Tyr340、Ala293、Leu393、Leu273、

圖4 活性成分與SRC的對接模式Fig.4 Molecular docking pattern of bioactive compounds with SRC main protease

圖5 活性成分與CTSK的對接模式Fig.5 Molecular docking pattern of bioactive compounds with CTSK main protease

Clu310和Clu339）幾乎相同，表明化合物JXT-13和內置配體對SRC具有相似的抑制作用。在圖5中，組織蛋白酶K抑制劑和化合物JXT-06在活性口袋中與周圍的氨基酸形成了相似的相互作用，這些抑制劑對酶活性抑制的作用機制都是利用抑制劑小分子的突觸基團直接與酶分子中Cys25位的巰基形成共價健，并依靠其它位點所形成的多個氫鍵和疏水鍵相互作用進一步穩固它們之間的這種結合，從而使酶失去活性。同時，兩個配體周圍的氨基酸（Asn161、Cly66、Leu209、Leu60、Cly64、Trp26和Gly65）幾乎相同，化合物JXT-06可能通過這些周圍氨基酸與組織蛋白酶K抑制劑表現出相同的作用。化合物JXT-13的結果與化合物JXT-06相似，其酚羥基與4MXO、4DMX形成新的相互作用氫鍵，表明這兩個化合物對靶點SRC和CTSK具有較強的結合能力。

3 結論

綜上所述，SRC和CTSK可能為雞血藤治療骨質疏松癥的核心靶點，分別與櫻黃素、甘草素等有效成分以氫鍵、疏水作用力等連接發揮治療作用。本研究基于網絡藥理學構建“成分-靶點-通路”網絡模型，并應用分子對接驗證分析，具有快速、高效篩選成分、靶點的作用。同時，該方法對雞血藤治療骨質疏松癥的作用機制進行了多維度、多層次分析，并對雞血藤的臨床應用具有積極意義，可為揭示中醫思維的科學價值提供理論支撐。此外，本實驗室將依據實驗結果開展體內、外生物學實驗，進一步為雞血藤治療骨質疏松癥提供實驗依據。