發酵型海帶-蘋果復合果汁飲料的研制及發酵體系抗氧化活性的研究

劉 茂，付曉婷，王 雷，許加超，高 昕

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

海帶（Saccharina japonica），又名昆布、江白菜，是一種在中國、日本、韓國等東方國家廣泛食用海洋蔬菜[1]。其產量豐富、富含海帶多糖、碘、甘露醇、巖藻黃素、褐藻多酚、昆布氨酸、牛磺酸等生物活性成分，其加工制品具有良好的功能特性[2]。我國的海帶養殖業產量及海帶加工產品和出口量一直處于世界領先地位，但我國的海帶加工產業仍以初級加工為主，附加值低[3]。因此，我國海帶精深加工產業亟待發展[4]。

根據GB/T 31121-2014《果蔬汁類及其飲料》的定義，發酵型果蔬汁飲料是指以果蔬或其初加工品作為主要原料，添加或不添加其他食品原輔料，再經過發酵制劑發酵而成的制品。其中，發酵菌種一般分為醋酸菌和乳酸菌兩類[5]。未發酵的果蔬汁富含礦物質、維生素，經過發酵后，可成為具有改善腸道健康降低血脂、改善乳糖不耐癥和提高機體免疫力等食療作用的功能性飲品[6]。通過采用乳酸菌生物發酵技術開發果蔬汁產品，不僅可以有效抑制其他微生物的生長，延長果蔬汁的貨架期，還能獲得更高的營養價值和更好的風味品質。該加工方式豐富了果蔬制品的種類，并為果蔬精深加工提供新思路，開拓了果蔬制品精深加工市場[7]。近年來，許多國家都增加了對發酵果蔬汁的研究。我國的科研工作者也相繼對一些果蔬原料如葛根、杏鮑菇、蘋果、藍莓、枸杞等進行了發酵研究[8]。

本研究選擇將海帶與蘋果汁復合并進行發酵，結合海帶汁和蘋果汁的風味及抗氧化活性，研制一款營養豐富、風味獨特的發酵型復合果蔬汁飲料。借助蘋果汁的清香和乳酸菌發酵產生的乳酸的風味，掩蓋海帶的腥味，解決海帶飲料腥味過重的制約性問題；同時探索海帶復合果汁飲料在發酵過程中抗氧化活性的變化，為海帶復合果汁飲料的開發提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干制海帶 威海新金鵬海洋生物科技有限公司；蘋果味果粉 上海雀巢有限公司；白砂糖 青島華潤澤食品有限公司；凍干型乳酸菌粉-植物乳桿菌

山東中科嘉億生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH） 97%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（98%）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）（99%） 大連美侖生物技術有限公司；其余試劑 均為國產分析純。

膠體磨 廊坊市廊通機械有限公司；高壓滅菌鍋 青島創合盛科教儀器設備有限公司；GXZ型智能光照培養箱 寧波江南儀器廠；醫用離心機 湘儀離心機儀器有限公司；酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵型海帶復合果汁飲料工藝流程 發酵型海帶復合果汁飲料工藝流程圖如圖1所示。

圖1 復合飲料工藝流程圖Fig.1 Processing scheme of fermented kelp-apple juice beverage

1.2.2 工藝操作要點

1.2.2.1 海帶汁的制備 用自來水沖洗經過挑揀的干制海帶后，放入燒杯中，加入約10倍水，放入水浴鍋中，60 ℃泡發2～3 h；將泡好的海帶剪碎成小顆粒狀，加入4倍水于膠體磨中勻漿，反復勻漿2～3次，直至海帶勻漿中沒有大的顆粒；將海帶勻漿置于燒杯中， 121 ℃/0.1 MPa高壓提取20 min；最后經100目紗布過濾，制得海帶汁。

1.2.2.2 果汁制備 將果粉與40 ℃左右飲用水以1:6（g/mL）的比例沖調，混合均勻，靜置冷卻至30 ℃以下備用。

1.2.2.3 海帶汁和果汁的調配 按照一定的比例將海帶汁-蘋果汁進行調配，并加入一定量的白砂糖，混合均勻后于高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.2.4 菌液的活化與發酵 在無菌環境下，將菌粉與MRS肉湯培養基混合制備成菌懸液，放入恒溫培養箱中，于32 ℃下活化24 h。離心后得到菌體，用0.85%的生理鹽水調整菌體濃度達到109CFU/mL備用。以一定的接種量接種至已經滅菌的海帶復合果汁中，于恒溫培養箱中32 ℃發酵24 h。

1.2.3 單因素實驗 以發酵型海帶復合果汁飲料的感官評分為評價指標，進行單因素實驗，依次探究海帶汁和蘋果汁的復配體積比、白砂糖添加量、植物乳桿菌接種量對發酵后的復合果汁飲料感官品質的影響。以上因素水平分別設置為海帶汁-蘋果汁復配體積比為2:1、1:1、1:2、1:3；白砂糖添加量為2%、3%、4%、5%；植物乳桿菌接種量為4%、6%、8%（v/v）。每次試驗時做2組平行試驗，按圖1的工藝流程進行操作。

1.2.3.1 海帶汁和蘋果汁的復配體積比 白砂糖添加量為3%，植物乳桿菌接種量為6%，海帶汁-果汁復配體積比分別為2:1、1:1、1:2、1:3，對發酵后得到的成品飲料進行感官評價，以探究海帶汁和蘋果汁的復配體積比對發酵后的復合果汁飲料感官品質的影響。

1.2.3.2 白砂糖添加量 海帶汁-果汁復配體積比為1:2，植物乳桿菌接種量為6%，白砂糖添加量分別為2%、3%、4%、5%，對發酵后得到的成品飲料進行感官評價，以探究白砂糖添加量對發酵后的復合果汁飲料感官品質的影響。

1.2.3.3 植物乳桿菌接種量 海帶汁-果汁復配體積比為1:2，白砂糖添加量為3%，植物乳桿菌接種量分別為4%、6%、8%，對發酵后得到的成品飲料進行感官評價，以探究植物乳桿菌接種量對發酵后的復合果汁飲料感官品質的影響。

1.2.4 正交試驗 以單因素實驗的結果作為參考，同樣以感官評分作為評價指標，選取（A）海帶汁-果汁復配體積比、（B）白砂糖添加量、（C）植物乳桿菌接種量3個因素作為自變量，并分別取3個水平，采用L9（34）正交試驗表設計進行正交試驗，對發酵型海帶復合果汁飲料進行工藝優化。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.5 感官評價 由10名經過食品感官評價課程培訓的食品科學與工程專業的學生，在專業的感官評定實驗室，采用專業的感官評定步驟，對不同工藝條件處理后的復合果蔬汁飲料進行感官評定，從復合飲料的色澤、氣味、滋味和組織狀態4個方面對飲料進行評定并打分，結果采用百分制[9-10]。根據每個評定人員的感官評分結果計算平均值，結果保留1位小數。發酵型海帶復合果汁飲料感官評定標準見表2。

表2 復合飲料感官評定標準表Table 2 Sensory evaluation criteria of the kelp-apple juice beverage

1.2.6 抗氧化活性測定試驗

1.2.6.1 樣品制備 海帶汁的制備等按圖1的工藝流程進行操作，4個樣品分別的配方如表3。

表3 樣品制備Table 3 Sample preparation

將樣品1#～4#，接種后置于32 ℃培養箱中，并于0、6、12、24 h分別取樣，取樣后于5000 r/min下離心25 min，離心后取上清液，分別裝入10 mL EP管中，于-20 ℃下冷藏保存。待用時于37 ℃水浴鍋中隔水解凍，用于DPPH、ABTS+自由基清除力以及FRAP總抗氧化能力測定。

比較樣品1#和2#的結果，探究海帶汁的添加對復合飲料抗氧化活性的影響；比較樣品3#和4#的結果，探究植物乳桿菌的接種發酵對復合飲料抗氧化活性的影響。

1.2.6.2 DPPH自由基清除力測定 DPPH自由基清除力測定參考Kriengsak等[11]以及Xie等[12]的方法，并進行修改。用無水乙醇制備DPPH工作液（0.1 mg/mL），待測樣品和DPPH工作液以1:1混合，室溫下避光反應30 min后，于515 nm波長處測吸光度。以抑制率表示自由基清除能力大小。計算公式如下：

式中：Asample為樣品+DPPH工作液的吸光值；Asampleblank為樣品+無水乙醇的吸光值；Acontrol為無水乙醇+DPPH工作液的吸光值；Acontrolblank為無水乙醇的吸光值。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除力測定 ABTS+自由基清除力測定參考Marino等[13]的方法，并進行修改。待測樣品和ABTS工作液以1:4混合，室溫避光反應10 min后，于734 nm波長處測吸光度。以抑制率表示自由基清除能力大小。計算公式如下：

式中：Asample為樣品+ABTS工作液的吸光值；Asampleblank為樣品+去離子水的吸光值；Acontrol為去離子水+ABTS工作液的吸光值；Acontrolblank為去離子水的吸光值。

1.2.6.4 FRAP總抗氧化能力測定 FRAP總抗氧化能力測定參考Aung等[14]的方法，并進行修改。待測樣品和FRAP工作液以1:9混合后，37 ℃避光反應10 min后，于593 nm波長處測吸光度。樣品的總抗氧化能力表示為吸光度值，相關研究表明兩者成正比[15]。吸光值需要減去樣品空白的吸光值，計算公式如下：

式中：Asample為樣品+FRAP工作液的吸光值；Asampleblank為去離子水+FRAP工作液的吸光值。

1.3 數據處理

每個實驗條件進行三次獨立的平行試驗；單因素實驗和抗氧化活性測定所得數據采用Excel 2016進行統計分析并作圖；正交試驗結果用正交試驗常用的結果分析方法，即極差分析，得出各因素的最優水平。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 海帶汁-蘋果汁復配體積比對海帶復合果汁飲料品質的影響 海帶汁-蘋果汁復配體積比直接影響了復合果汁飲料的風味和滋味。海帶汁-蘋果汁復配體積比對飲料品質的影響由圖2可知，當海帶汁-果汁復配體積比為1:2時，飲料的口感達到最佳狀態，既有蘋果汁的滋味和香氣又含有海帶的特殊風味。當海帶汁占比較多時，復合飲料帶有較大的海帶腥味，感官評分較低，當海帶汁占比較少時，蘋果汁的甜香味掩蓋住海帶特有的香氣和風味，且飲料顏色發暗。安興娟等[16]在枸杞汁與胡蘿卜汁復配研究中，應用感官評價法，枸杞汁與胡蘿汁的體積比為3:7時，口味適中，澀味較輕，確保了發酵飲料能夠具有理想的色澤和口感。

圖2 溶液體積比對飲料感官品質的影響Fig.2 Effect of volume ratio of two solution on the sensory qualities of beverage

2.1.2 白砂糖添加量對海帶復合果汁飲料品質的影響 白砂糖既可以為乳酸菌發酵提供碳源，又可以調節果蔬汁的甜度，其濃度大小對發酵果蔬汁的酸甜比及其整體風味具有顯著影響。當白砂糖添加量過小時，復合飲料糖分不足，造成不完全發酵，從而酸味較大地影響感官，同時飲料口感不夠醇厚香甜；而如果添加量過大，飲料糖酸比變大，顯得甜膩，不夠爽口，也可能會使過量可發酵糖轉化為酸類、酯類、醇類等物質[17]。影響復合飲料的整體風味。白砂糖添加量對發酵型復合果蔬汁飲料品質的影響由圖3可知，在白砂糖添加量在3%的時候，其感官評分出現最大值，表明這時候的復合飲料風味最能令人滿意。

圖3 白砂糖添加量對飲料感官品質的影響Fig.3 Effect of the added amount of white sugar on the sensory quality of beverage

2.1.3 植物乳桿菌接種量對海帶復合果汁飲料品質的影響 植物乳桿菌的接種量直接影響復合飲料的風味和口感，當接種量過小時，活菌數較少，飲料中的糖分得不到充分利用，產酸少，從而使飲料過于甜膩；當接種量過大，菌體自身生命活動所消耗的糖也隨之增加，飲料中大部分糖分用于菌種生長，使飲料口感變差[18]。枸杞汁與胡蘿卜汁發酵體系中，當接種量為5%時產品綜合品質較高[16]。刺梨-猴頭菇乳酸菌發酵體系中，接種量大于2%時發酵液有酒味和刺激感，最適接種量為2%[19]。植物乳桿菌接種量對飲料品質的影響由圖4可知，當接種量在6%時，復合飲料感官評分出現峰值，其感官品質最好。

圖4 植物乳桿菌接種量對飲料感官品質的影響Fig.4 Effect of the inoculation amount of Lactobacillus plantarum on the sensory quality of beverage

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果如表4所示。正交試驗的結果顯示，所探究的各因素的最佳條件為：A2：海帶汁-蘋果汁復配體積比1:2，B2：白砂糖添加量3%，C3：植物乳桿菌接種量8%。驗證試驗表明，此時的復合飲料色澤明亮、均勻無沉淀；具有蘋果清香和海帶特有的風味，無腥味；酸甜比例適中，口感細膩潤滑。

表4 正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test

2.3 海帶汁的添加及發酵對飲料抗氧化活性影響

2.3.1 海帶汁的添加對復合飲料抗氧化活性的影響由圖5～圖6可知，海帶蘋果汁發酵樣品，在發酵期內，隨著發酵的進行，其DPPH自由基清除力有明顯上升的趨勢，而單獨蘋果汁發酵樣品，其DPPH自由基清除力明顯降低；ABTS+自由基清除力有所下降，但其下降趨勢明顯低于單獨蘋果汁發酵樣品。由圖7可看出，海帶蘋果汁發酵樣品總抗氧化能力明顯高于蘋果汁發酵樣品。以上結果表明：海帶汁的添加對復合飲料抗氧化活性具有顯著提高作用。復合發酵對飲料DPPH自由基清除力抗氧化活性具有顯著提高作用，且海帶汁的加入能彌補單獨蘋果汁發酵抗氧化能力的下降。

圖5 海帶汁的添加對DPPH自由基清除力的影響Fig.5 Effects of kelp juice on DPPH free radicals scavenging power

圖6 海帶汁的添加對ABTS+自由基清除力的影響Fig.6 Effects of kelp juice on ABTS+ free radicals scavenging power

圖7 海帶汁的添加對總抗氧化力的影響Fig.7 Effects of kelp juice on total antioxidant capacity

蘋果多酚是蘋果的主要抗氧化物質之一[20]。有研究表明，蘋果汁在發酵前4 d左右，其總酚含量呈降低趨勢[21]，本試驗總發酵期為24 h，故其抗氧化活性隨總酚含量的降低而降低。引起蘋果汁總酚含量降低的原因有很多，如蘋果多酚在發酵過程中與蘋果果汁中少量的蛋白相結合，形成聚合物，使得蘋果汁總酚含量降低[22]；另外，發酵過程中乳桿菌的生長都在一定程度上受到酚類物質的抑制作用，乳桿菌為保持生長，則會降解部分酚類物質，這樣也會使的體系總酚含量降低[23-24]。

2.3.2 發酵對復合飲料抗氧化活性的影響 由圖8～圖9可知，海帶汁接種樣品，在發酵期內，隨著發酵的進行，其DPPH自由基清除力有所下降，但其下降趨勢明顯低于海帶汁不接種樣品。ABTS+自由基清除力有明顯上升的趨勢，而海帶汁不接種樣品，其ABTS+自由基清除力明顯降低。圖10中兩樣品總抗氧化能力趨勢和其ABTS+自由基清除力趨勢一致。以上結果表明，植物乳桿菌的接種對飲料抗氧化活性各指標均有明顯提高。

圖9 發酵對ABTS+自由基清除力的影響Fig.9 Effects of fermentation on ABTS+ free radicals scavenging power

圖10 發酵對總抗氧化能力的影響Fig.10 Effects of fermentation on total antioxidant capacity

海帶汁抗氧化活性隨發酵明顯提高的最主要的原因是隨著乳酸菌的發酵，體系pH下降，海帶多糖在酸性條件下降解，導致海帶細胞壁被破壞，海帶細胞中的多酚類物質溶出，增加了體系中抗氧化劑濃度[25]。并且，降解后的海帶多糖，變成更多小分子多糖，增加了還原糖的種類及數量，從而增強了復合飲料的抗氧化活性。另外，相關研究表明，具有不同結構的多酚可能具有不同的抗氧化活性抗氧化活性[26]，尤其是對自由基的清除力存在較大影響[27]。故有可能隨著發酵的進行，海帶中的多酚物質結構被改變，變成具有更高抗氧化活性的酚類物質，從而提高了復合飲料的抗氧化活性。

整體來看，海帶汁和蘋果汁均具有一定的抗氧化能力，發酵使得海帶汁的抗氧化能力提高，但會使得蘋果汁的抗氧化能力降低。但是單純的海帶汁發酵，其口感風味較差，需添加蘋果汁使產品具有蘋果清香和海帶特有的風味。另一方面，海帶汁的加入能彌補單獨蘋果汁發酵抗氧化能力的下降，復合發酵對飲料DPPH自由基清除力具有明顯提高作用。由此可見，海帶汁和蘋果汁的復配及發酵，對提高飲料的風味和抗氧化能力是有益的。

體外抗氧化活性試驗結果表明，本課題研制的成品海帶蘋果復合飲料對DPPH自由基抑制率為73.20%，對ABTS+自由基抑制率為36.05%，總抗氧化能力（用吸光度值表示）為0.774。通過查閱文獻得知，李長見[28]研制的小米發酵飲料對DPPH自由基抑制率為80%，對ABTS+自由基抑制率為83%。馬澤剛等[29]研制的絞股藍飲料原液滅菌后對DPPH自由基抑制率為50%±0.6%，對ABTS+自由基抑制率為13.69%±0.45%。對比來看，本實驗研制的發酵型海帶復合果汁飲料具有較強的抗氧化活性。

3 結論

本研究研制了一款發酵型海帶復合果汁飲料。通過單因素試驗以及正交試驗分析得出復合飲料的最優發酵條件為：海帶汁-蘋果汁復配體積比為1:2、白砂糖添加量為3%、植物乳桿菌接種量為8%、發酵溫度32 ℃、發酵時間24 h。按照該工藝所制得的復合飲料色澤明亮、均勻無沉淀；具有蘋果清香和海帶特有的風味，無腥味；酸甜比例適中，口感細膩潤滑。抗氧化活性試驗結果顯示：海帶汁的添加和植物乳桿菌的接種對復合飲料的抗氧化活性具有明顯的積極影響。最終配方的復合飲料對DPPH、ABTS+自由基抑制率分別為73.20%和36.05%，總抗氧化能力為0.774。本研究所研制的發酵型海帶復合果汁飲料風味優良、營養豐富、抗氧化性好，具有良好的應用前景。解決了海帶產品常見的腥味問題，為海帶的精深加工提供了新的思路和指導。