乙醇-硫酸銨雙水相體系提取桃花總黃酮及其抗氧化性能

俞耀文，戴國(guó)慶, ，華浩立，俞 杰, ，ZHYLKO Viachaslau

（1.浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015；2.白俄羅斯國(guó)立大學(xué)國(guó)際薩哈羅夫環(huán)境研究所，明斯克州明斯克220070）

桃花是薔薇科落葉喬木桃樹(shù)的花，具有美容養(yǎng)顏和保健之功效，在食藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。研究表明，桃花中含有黃酮、多酚、多糖、類胡蘿卜素、多種維生素、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分[1-3]，營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值較高。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抗輻射等多種藥理作用[4-6]，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2,7]，桃花中含有阿福豆苷（afzelin）、槲皮苷（quercitrin）、柚皮素（naringenin）以及三葉豆苷（trifolin）等多種黃酮化合物，說(shuō)明桃花中黃酮類物質(zhì)豐富[8]。

近年來(lái)，學(xué)者們主要采用以乙醇為溶劑的浸提法[7-8]，并結(jié)合超聲波輔助[9]、大孔樹(shù)脂純化[10]以及索氏提取[11]等方法，研究了桃花總黃酮的提取工藝。雙水相提取技術(shù)是一種新型的萃取分離技術(shù)[12]，根據(jù)物質(zhì)在互不相溶兩相間溶解性的差異，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的萃取和分離，被廣泛用于生物化學(xué)和生物化工產(chǎn)品的分離純化[13]。目前，雙水相萃取技術(shù)已有效應(yīng)用于黃酮類化合物[14-16]等天然產(chǎn)物的提取。但雙水相體系在桃花總黃酮中的提取研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取桃花總黃酮，以黃酮的得率為指標(biāo)，考察了硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間等因素的影響，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了提取工藝，并研究了黃酮提取物的抗氧化活性，以期為桃花的綜合利用以及黃酮化合物等天然產(chǎn)物的深度開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃花 產(chǎn)地為安徽省亳州市；蘆丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水乙醇、硫酸銨、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、七水合硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雙氧水（30%質(zhì)量濃度）上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、抗壞血酸（VC） 上海麥克林生化科技有限公司；濃鹽酸 西隴科學(xué)股份有限公司；蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

CPA225D分析天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；DZF型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SK220H型超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；TDZ5-WS式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桃花原料預(yù)處理 將桃花剝?nèi)セㄍ泻洼嗥糜谡婵崭稍锵洌?0 ℃，2 h）烘干，然后放入研缽中研磨至粉狀，過(guò)60目篩。過(guò)篩后的桃花粉末避光冷藏（8 ℃）。

1.2.2 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖制作 用Albertson濁點(diǎn)法[17]測(cè)定并制作乙醇-硫酸銨體系相圖。準(zhǔn)確稱取4.5 g硫酸銨于錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌至硫酸銨完全溶解，靜置。用滴定管向錐形瓶中緩慢滴加無(wú)水乙醇并震蕩錐形瓶，直到混合溶液出現(xiàn)渾濁為止，記錄此時(shí)消耗的無(wú)水乙醇體積。用滴定管向上述混合體系中滴加蒸餾水并振蕩錐形瓶，直至體系重新變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)，記錄此時(shí)消耗的蒸餾水體積。不斷重復(fù)上述操作，記錄所加入的乙醇體積和水體積，計(jì)算狀態(tài)改變時(shí)體系中硫酸銨和乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并繪制雙水相相圖。

1.2.3 桃花總黃酮提取工藝 乙醇-硫酸銨雙水相提取桃花總黃酮工藝如下[15]：準(zhǔn)確稱取一定量硫酸銨，置于燒杯中，并加入適量的乙醇溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%），在超聲作用下，攪拌至顆粒完全溶解，靜置直到溶液分相。按液料比準(zhǔn)確稱取一定量的桃花粉末，加入燒杯中，在恒溫加熱磁力攪拌器上加熱一定時(shí)間后，倒入10 mL的離心管中，并在2500 r/min的條件下離心5 min，取上相澄清液作為待測(cè)液。

1.2.4 桃花總黃酮的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法，選用510 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定桃花中總黃酮[18]。

1.2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取10 mg蘆丁于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，用60%濃度的乙醇定容至刻度，搖勻后，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6只標(biāo)記好的10 mL容量瓶，分別加入0、1、2、3、4、5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水至5 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后靜置5 min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，加水稀釋至刻度線，搖勻后靜置10min。以第一管為對(duì)照組，在510 nm處測(cè)定吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到蘆丁濃度與吸光度的線性回歸方程：y=8.92857x+0.00429，R2=0.999。

1.2.4.2 桃花總黃酮得率測(cè)定 準(zhǔn)確吸取2.5 mL待測(cè)液，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻，靜置，并從中準(zhǔn)確吸取2.5 mL加入25 mL容量瓶中。然后，加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，溶液無(wú)明顯變化；再加入10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，溶液變棕黃色；再加入4%的氫氧化鈉溶液10 mL，溶液變?yōu)榫萍t色，加水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min。然后測(cè)定吸光度。

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量提取液中的黃酮濃度，然后根據(jù)式（1）計(jì)算桃花總黃酮得率。

式中：C—上相提取液的黃酮濃度，mg/mL；V—上相提取液的體積，mL；n—稀釋倍數(shù)；m—稱取的桃花粉末質(zhì)量，mg；Y—桃花總黃酮得率，%。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定液料比為35:1（mL/g），提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為30 min，分別設(shè)置硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%、13%、15%、17%、19%，檢測(cè)黃酮得率。

液料比對(duì)黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為30 min，分別設(shè)置液料比為20:1、25:1、30:1、35:1、40:1（mL/g），檢測(cè)黃酮得率。

提取溫度對(duì)黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，液料比為30:1（mL/g），提取時(shí)間為30 min，分別設(shè)置提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，檢測(cè)黃酮得率。

提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，液料比為30:1（mL/g），提取溫度為50 ℃，分別設(shè)置提取時(shí)間為15、20、25、30、35 min，檢測(cè)黃酮得率。

1.2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比、提取溫度這4個(gè)因素作為自變量，以黃酮得率為響應(yīng)值。運(yùn)用Box-Bchnken中心組合設(shè)計(jì)方案[19]，利用Design-Expert8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平Table 1 Code and level of factors for the response surface analysis experiment

1.2.7 抗氧化實(shí)驗(yàn)研究 通過(guò)對(duì)DPPH·、OH·、以及自由基的清除能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，并分別以VC為對(duì)照，研究桃花總黃酮的抗氧化性能。

1.2.7.1 樣品溶液制備 按照1.2.6的方法所選出的優(yōu)化條件，提取桃花總黃酮，然后加入一定量的無(wú)水乙醇稀釋，得到黃酮質(zhì)量濃度為0.112、0.224、0.336、0.448、0.56、0.672 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，分別記為1、2、3、4、5、6號(hào)，密閉冷藏（8 ℃）。

1.2.7.2 桃花總黃酮對(duì)DPPH·清除能力 參考文獻(xiàn)[20]方法，并稍作修改。用80%的乙醇溶液配制0.15 mmol/L的DPPH溶液100 mL，避光保存。分別吸取1、2、3、4、5、6號(hào)樣品溶液各2 mL，置于10 mL的離心管中，各加入DPPH溶液2 mL，搖勻后，靜置30 min。同時(shí)，以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，作為對(duì)照組；以無(wú)水乙醇代替待測(cè)液，作為空白組。均在517 nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)式（2）計(jì)算自由基清除率。

式中：I—自由基清除率，%；A0—加入DPPH溶液和無(wú)水乙醇的吸光度；Ai—加入DPPH溶液和粗提液的吸光度；Aj—加入無(wú)水乙醇和粗提液的吸光度。

1.2.7.3 桃花總黃酮對(duì)OH·清除能力 參考文獻(xiàn)[21]方法，并稍作修改。精確吸取9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液2 mL，置于10 mL的離心管中，然后分別加入1、2、3、4、5、6號(hào)樣品溶液各2 mL，再分別加入9 mmol/L水楊酸溶液2 mL和8.8 mmol/L的雙氧水溶液2 mL，搖勻后，靜置30 min。同時(shí)，以蒸餾水代替雙氧水溶液，作為對(duì)照組；以蒸餾水代替待測(cè)液，作為空白組。均在510 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和圖表制作，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖

乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖如圖1所示。曲線上的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，在曲線上方為兩相區(qū)，其中上相為富乙醇相，而下相則為富鹽相，黃酮類物質(zhì)多具有二苯基色原酮的黃酮母體結(jié)構(gòu)，極性較小，從而富集于上相[15]，而如多糖等極性較大的物質(zhì)則多富集于下相，因而可使桃花中的黃酮得以分離。因此，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，乙醇和硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)落于曲線之上，并取上相澄清液作為待測(cè)液進(jìn)行研究。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖Fig.1 Phase diagram of aqueous two-phase system of ethanol and ammonium sulfate

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響 如圖2所示，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黃酮得率先增加而后降低，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值。可能的原因是，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，硫酸銨對(duì)雙水相體系中水分子的束縛能力增強(qiáng)[23]，使得上相中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，從而有利于促進(jìn)黃酮物質(zhì)的溶出，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加時(shí)，硫酸銨在上相中的濃度也隨之增加，從而不利于黃酮物質(zhì)的萃取。因此，選取硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on the extraction rate of flavonoids

2.2.2 液料比對(duì)黃酮得率的影響 如圖3所示，隨著液料比的增加，黃酮得率先增加后降低，在液料比為30:1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值。可能原因是，溶劑用量的增加使得細(xì)胞內(nèi)外的質(zhì)量濃度差變大，傳質(zhì)推動(dòng)力、內(nèi)擴(kuò)散的速率增大，從而有利于黃酮的溶出。但隨著液料比進(jìn)一步增加，溶劑量增多雜質(zhì)成分溶出增多，影響黃酮類物質(zhì)的浸出，從而導(dǎo)致其得率降低[19]。因此，30:1（mL/g）為黃酮提取的較佳料液比，由于35:1（mL/g）時(shí)黃酮得率大大降低，故選擇20:1～30:1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 液料比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.2.3 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響 如圖4所示，隨著提取溫度的升高，黃酮得率先快速增加而后逐步降低，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，達(dá)到最大值。可能的原因是，當(dāng)溫度升高時(shí)，黃酮的溶出率也相應(yīng)增大，因此得率升高。但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)有可能會(huì)被破壞[22]，從而導(dǎo)致得率降低。因此，黃酮提取的較佳溫度為50 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 如圖5所示，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮得率先增加而后降低，當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值。可能的原因是，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮化合物的溶出量逐步增加，當(dāng)提取時(shí)間為25 min時(shí)，黃酮類化合物已基本溶出，繼續(xù)加熱可能會(huì)破壞黃酮的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致黃酮得率降低。因此，較佳的提取時(shí)間為25 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行了4因素3水平共29個(gè)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，具體結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Designandresults for response surface test

2.3.1 模型建立和顯著性分析 利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和多元回歸擬合，建立以黃酮得率為函數(shù)的二次回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。黃酮得率（Y）與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）的二次回歸方程為：

從表3可知，本實(shí)驗(yàn)所選用回歸模型具有極好的顯著性（P＜0.01），模型決定系數(shù)R2=0.9785%，擬合度較高，校正系數(shù)R2adj=0.9570，說(shuō)明該模型方程能夠解釋95.70%的響應(yīng)值變化。失擬項(xiàng)P=0.2248＞0.05，表明該模型失擬項(xiàng)不顯著，模型整體的絕對(duì)誤差較小，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面分析模擬選擇得率與各因素之間的函數(shù)作用關(guān)系具有一定的科學(xué)合理性[24]。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)桃花總黃酮得率的影響程度由大到小依次為B＞C＞D＞A，即液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)。此外，A、B、C、D、AB、A2、B2、C2、D2對(duì)黃酮得率影響極顯著（P＜0.01），AD對(duì)黃酮得率影響顯著（P＜0.05）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for response surface test

殘差的正態(tài)分布規(guī)律如圖6所示。由圖6可知，實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際測(cè)定值與預(yù)測(cè)值之間吻合性良好，二者的散點(diǎn)分布概率幾乎為直線，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果整體標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值相較于得率可忽略不計(jì)[24]。

圖6 殘差的正態(tài)分布規(guī)律圖Fig.6 Normal distribution of residuals

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 通過(guò)響應(yīng)面分析軟件對(duì)各個(gè)因素之間的交互作用進(jìn)行分析，繪制了各因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面圖（圖7～圖12）。等高線的性狀可以反映各因素間交互作用的強(qiáng)弱關(guān)系[19]。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和液料比的等高線呈橢圓形，其交互作用最為顯著，其次為硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取溫度、液料比和提取溫度、液料比和提取時(shí)間以及提取溫度和提取時(shí)間的交互作用不顯著。這與表3的顯著性分析結(jié)果一致。

圖7 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和液料比交互作用對(duì)黃酮得率的影響Fig.7 Interaction of mass fraction of ammonium sulfate and solid-to-liquid ratio on the yield of flavonoids

圖8 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用對(duì)黃酮得率的影響Fig.8 Interaction of mass fraction of ammonium sulfate and extraction temperature on the yield of flavonoids

圖9 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間交互作用對(duì)黃酮得率的影響Fig.9 Interaction of mass fraction of ammonium sulfate and extraction time on the extraction rate of flavonoids

圖10 液料比和提取溫度交互作用對(duì)黃酮得率的影響Fig.10 Interaction of solid-to-liquid ratio and extraction temperature on the yield of flavonoids

圖12 提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)黃酮得率的影響Fig.12 Interaction of extraction temperature and extraction time on the yield of flavonoids

2.3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)的最佳提取條件為：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.18%、液料比為27.75:1（mL/g）、提取溫度為51.11 ℃、提取時(shí)間為26.11 min。考慮到實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作，將硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)整為15.2%，液料比調(diào)整為27.8:1（mL/g），提取溫度調(diào)整為51 ℃，提取時(shí)間調(diào)整為26 min。在此條件下，黃酮得率理論值可達(dá)45.64%。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，黃酮得率分別為45.65%、45.61%、45.70%，平均值為45.65%，與理論值十分接近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)黃酮得率。

圖11 液料比和提取時(shí)間交互作用對(duì)黃酮得率的影響Fig.11 Interaction of solid-to-liquid ratio and extraction time on the yield of flavonoids

此外，和文獻(xiàn)[11]報(bào)道相似，本實(shí)驗(yàn)桃花總黃酮得率較高，可能和植物所在的不同時(shí)期有關(guān)[25]。實(shí)驗(yàn)中所使用的原料為桃花花苞，采收時(shí)處于生長(zhǎng)期，推測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)良好，營(yíng)養(yǎng)成分吸收充足[26]。

2.4 桃花總黃酮抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 對(duì)DPPH·的清除能力 由圖13可知，隨著濃度的增加，VC清除DPPH·能力逐步升高，當(dāng)濃度為0.336 mg/mL時(shí)，清除率已達(dá)到95.63%，繼續(xù)增大濃度清除率無(wú)明顯變化。隨著濃度的增加，桃花總黃酮對(duì)清除DPPH·的能力逐步增加，當(dāng)樣品濃度為0.56 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH·的清除率為94.21%，接近VC水平，說(shuō)明桃花總黃酮對(duì)DPPH·有較強(qiáng)的清除能力，與文獻(xiàn)[27-28]研究黃酮抗氧化的結(jié)論相似。

圖13 桃花黃酮對(duì)DPPH·的清除能力Fig.13 DPPH· scavenging ability of peach blossom flavonoids

2.4.2 對(duì)OH·清除能力 如圖14所示，隨著濃度的增加，VC清除OH·能力逐步升高，當(dāng)濃度為0.448 mg/mL時(shí)，清除率幾乎可達(dá)100%[22]。在所考察的濃度范圍內(nèi)，桃花總黃酮對(duì)OH·的清除能力隨濃度的增加呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)樣品濃度為0.672 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)91.23%，說(shuō)明其對(duì)OH·有較強(qiáng)的清除能力，與文獻(xiàn)[22,29]研究黃酮抗氧化的結(jié)論相似。

圖14 桃花黃酮對(duì)OH·的清除能力Fig.14 Scavenging ability of Flavonoids from peach blossom to OH·

圖15 桃花黃酮對(duì)的清除能力Fig.15 Scavenging ability of peach blossom flavone to O-2·

植物黃酮的抗氧化能力是存在植物體內(nèi)所有黃酮化合物共同作用的結(jié)果[31]。黃酮結(jié)構(gòu)上為多羥基酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的供氫能力，并且可直接參與自由基的清除[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桃花黃酮對(duì)DPPH·、OH·和O2-·具有較強(qiáng)的清除能力，可作為一種潛在的天然抗氧化劑。

3 結(jié)論

采用乙醇-硫酸銨雙水相體系來(lái)提取桃花中總黃酮。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比、提取溫度4個(gè)影響因素為自變量，以黃酮得率為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)優(yōu)化總黃酮的提取工藝。最佳工藝參數(shù)為：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.2%、液料比27.8:1（mL/g）、提取溫度為51 ℃、提取時(shí)間26 min。在此條件下，黃酮得率理論值可達(dá)45.64%，驗(yàn)證值為45.65%，與理論值十分接近。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桃花總黃酮對(duì)DPPH·、OH·和O2-·表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，當(dāng)濃度為0.56 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率為94.21%，當(dāng)濃度為0.672 mg/mL時(shí)，OH·和清除率分別為91.23%和80.65%，表明其具有良好的抗氧化性能。該試驗(yàn)結(jié)果可為桃花中黃酮等活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考，具有一定的理論研究及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。