高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定阿膠塊中不同膠類的特征性多肽

沙小梅，張麗君，蔣文麗，王光耀，謝作樺，黃國太，涂宗財(cái),4,

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西南昌 330022；2.江西德上制藥股份有限公司，江西樟樹 331208；3.江西德上醫(yī)藥研究院有限公司，江西樟樹 331208；4.南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）

阿膠是驢皮膠原蛋白適度水解斷裂而得到的產(chǎn)物，因其具有補(bǔ)血、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等保健功效，受到廣大消費(fèi)者的喜愛，并與人參、鹿茸并稱為三大最具價(jià)值的傳統(tǒng)中藥材[1-2]。近年來，隨著人們生活水平的提高以及保健意識(shí)的增強(qiáng)，人們對阿膠的購買力明顯增長，阿膠市場規(guī)模逐年遞增。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，從2009到2019年，阿膠市場規(guī)模復(fù)合年增長率達(dá)到18.1%，并且，《山東省醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2018～2022年）》中明確提出做大阿膠市場，阿膠市場規(guī)模有望進(jìn)一步擴(kuò)大[3-4]。然而，驢皮資源緊缺造成阿膠價(jià)格上漲，在利益的驅(qū)使下，不法商家向阿膠中大量摻入其他相對低價(jià)的牛皮明膠或豬皮明膠，制成的摻假阿膠阻礙了阿膠市場的健康發(fā)展，引發(fā)了消費(fèi)者的購買擔(dān)憂[5-7]。因此，阿膠產(chǎn)品中膠類來源的鑒別研究對規(guī)范阿膠市場秩序具有重要意義。

目前，國內(nèi)外已公開報(bào)道了多種用于哺乳動(dòng)物明膠（尤其是豬明膠和牛明膠）鑒定的方法，包括紅外光譜法[8]、電泳技術(shù)[9]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[10-11]、酶聯(lián)免疫吸附測定[12-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[14-15]等。相比之下，HPLCMS/MS技術(shù)是被認(rèn)為準(zhǔn)確度最高的明膠鑒定方法，受到國內(nèi)外研究者的認(rèn)可[16-17]。同時(shí)，HPLC-MS/MS也被用于阿膠的鑒定中，如Cheng等[18]運(yùn)用HPLCMS/MS開展了阿膠、牛皮明膠、豬皮明膠、龜甲膠和鹿角膠的鑒定研究，在每種明膠中鑒定出1個(gè)特征性多肽；焦陽等[19]利用HPLC-MS/MS確定了1個(gè)區(qū)別于阿膠的馬皮源特征性多肽。本課題組在前期以阿膠、豬明膠和牛明膠為研究對象，運(yùn)用HPLC-MS/MS確定了不同比例混合明膠中低含量目標(biāo)明膠的多個(gè)特征性多肽[20]。目前市面上的阿膠產(chǎn)品中以阿膠塊占比最大[21]。然而，目前關(guān)于阿膠塊產(chǎn)品中的阿膠和其他來源明膠的溯源研究少有報(bào)道，這值得深入研究和探索。

基于阿膠市場的快速發(fā)展和阿膠的溯源研究現(xiàn)狀，本文以目前阿膠市場占比最大的阿膠塊為研究對象，向其中分別加入在食用明膠市場中占比最大的豬明膠和牛明膠，采用HPLC-MS/MS分別鑒定阿膠塊中阿膠、豬明膠和牛明膠的特征性多肽，為阿膠塊產(chǎn)品的準(zhǔn)確鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4種阿膠塊產(chǎn)品 分別來自東阿阿膠股份有限公司、山東福牌阿膠股份有限公司、北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司和九芝堂股份有限公司；牛皮明膠、豬皮明膠 美國sigma公司；胰蛋白酶（酶活力：19385 U/mg） 美國Promega Corporation公司；其他試劑 均為分析純。

LGJ-1D-80型冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；EASY-nLC? 1000色譜系統(tǒng)、Q-Exactive質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；RP-C18液相色譜柱（0.15 mm×150 mm，5 μm） 美國Column Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿膠塊樣品的處理 用去離子水將4種阿膠塊產(chǎn)品在50 ℃水浴鍋中分別溶解制成100 mg/mL的阿膠溶液，同時(shí)分別向其中加入低含量的牛明膠和豬明膠，使得牛明膠和豬明膠在整個(gè)溶液體系中的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，攪拌均勻制成阿膠-牛明膠-豬明膠的混合溶液。置于離心機(jī)中以6000 ×g的速度離心25 min，所得上清液進(jìn)一步通過0.45 μm的過濾器處理，將得到的濾液凍干，備用。

1.2.2 樣品的酶解 樣品參照課題組前期的方法進(jìn)行酶解[22]。將凍干后的樣品溶解于SDT緩沖液（4 mg/mL十二烷基硫酸鈉、100 mmol/L二硫蘇糖醇、150 mmol/L pH8.0三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）溶液）并制成質(zhì)量濃度為1 μg/μL的溶液，于沸水中加熱3 min后在離心機(jī)中12000×g離心15 min。將上清液置于超濾離心管（截留分子質(zhì)量為10 kDa）中，加入200 μL尿素裂解液（8 mol/L尿素，150 mmol/L pH8.0 Tris-HCl溶液）后以14000×g離心15 min。往濃縮物中加入200 μL尿素裂解液后再次離心。然后，加入100 μL 50 mmol/L的碘乙酰胺溶液，于暗室放置30 min后14000×g離心15 min。之后，加入100 μL尿素裂解液，14000×g離心15 min，重復(fù)此操作2次。加入100 μL的25 mmol/L NH4HCO3溶液并14000×g離心30 min，重復(fù)操作2次。最后，在濃縮物中加入含2 μg胰蛋白酶的40 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液，37 ℃放置反應(yīng)20 h后14000×g離心20 min收集濾液，即得到明膠多肽溶液。

1.2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜檢測 混合明膠酶解液運(yùn)用Easy nLC-Orbitrap Fusion Tribrid質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。流動(dòng)相A為含有體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)84%的乙腈溶液（含有體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸）。RP-C18色譜柱以95%的A液進(jìn)行平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Zorbax 300SBC18peptide traps，經(jīng)色譜柱以250 nL/min的流速洗脫60 min，流動(dòng)相A線性梯度變化為流動(dòng)相B。采用數(shù)據(jù)依賴采集模式動(dòng)態(tài)收集豐度最高的10個(gè)母離子（m/z范圍為300～1800）進(jìn)行高能碰撞解離（high energy collision dissociation，HCD）模式碎裂。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為20 s，歸一化碰撞能量為27 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MASCOT軟件（Matrix Science, London,UK; version 2.2）匹配分析所獲得的質(zhì)譜圖，數(shù)據(jù)庫設(shè)置為目標(biāo)膠原蛋白（驢皮、牛皮和豬皮膠原蛋白）數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)包括：半胱氨酸碘乙酰胺化（C）為固定修飾；氧化（M、P、K）為可能性修飾；最大漏切位點(diǎn)數(shù)為2；一級質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±20×10-6；二級質(zhì)譜錯(cuò)誤率為±0.1 Da。當(dāng)Mascot分?jǐn)?shù)大于40時(shí)，多肽峰被認(rèn)定為陽性鑒定或準(zhǔn)確度極高（P＜0.05）[23]。阿膠、牛明膠和豬明膠特征性多肽的比對分析是依據(jù)課題組前期建立的3種膠原蛋白理論特征性多肽數(shù)據(jù)庫開展的[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠塊中阿膠、牛明膠和豬明膠的特征性多肽差異性分析

本課題組前期研究了不同加熱溫度對豬皮明膠鑒定效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度下制備的豬皮明膠特征性多肽有所不同[22]。由于阿膠與其他來源的明膠類似，在不同生產(chǎn)廠家，阿膠塊的生產(chǎn)工藝和參數(shù)可能會(huì)略有不同，其分子鏈的斷裂程度會(huì)受到多種因素（如加熱溫度、提取時(shí)間、酸堿性等）的影響[24]，進(jìn)而可能會(huì)對阿膠溯源產(chǎn)生一定影響。因此，從廣受消費(fèi)者青睞的阿膠塊中找出共有的阿膠特征性多肽對于阿膠塊產(chǎn)品的溯源鑒定研究顯得十分必要。故選取了4種知名品牌的阿膠塊（同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊）分別鑒定阿膠特征性多肽，并通過韋恩圖分析不同品牌阿膠塊中阿膠特征性多肽的差異性，并確定4種阿膠塊中共有的阿膠特征性多肽。由圖1a可知，同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊經(jīng)HPLCMS/MS并匹配驢皮多肽數(shù)據(jù)庫分別鑒定出31、30、36和37個(gè)阿膠特征性多肽，其中4種品牌的阿膠塊共有18個(gè)特征性多肽，對阿膠塊產(chǎn)品中阿膠成分的溯源鑒定有十分重要的意義。除此之外，同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊分別被鑒定出13、12、18和19個(gè)非共有阿膠特征性多肽，這些多肽的質(zhì)譜峰只在1種、2種或者3種阿膠塊的質(zhì)譜圖中被檢出，因而不適宜用于阿膠塊的溯源鑒定。

圖1 阿膠塊中阿膠、牛明膠和豬明膠特征性多肽組成的差異性分析Fig.1 Differential analysis of the characteristic peptides composition of donkey-hide gelatin, bovine gelatin and porcine gelatin in donkey-hide gelatin lumps

除了鑒定阿膠塊中的阿膠特征性多肽，若能同時(shí)找出其他來源明膠的特征性多肽，將有利于阿膠塊產(chǎn)品中摻假明膠的鑒別分析。因此，本文以4種阿膠塊為原料，向其中加入1 mg/mL的牛皮明膠和豬皮明膠，通過HPLC-MS/MS鑒定牛明膠和豬明膠的特征性多肽。由圖1b可知，加入牛明膠后，經(jīng)過過濾、離心、酶解等多種前處理工序后，與牛皮多肽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊中分別鑒定出8、10、7和10個(gè)牛明膠特征性多肽，其中有3個(gè)特征性多肽均能在4種阿膠塊中被檢出，可作為阿膠塊中追溯是否摻有牛明膠的依據(jù)。然而，4種品牌的阿膠塊中還分別有5、7、4和7個(gè)非共有的牛明膠特征性多肽被檢出，這些特征性多肽不能同時(shí)在4種阿膠塊中被鑒定出來可能是因?yàn)樵诎⒛z塊前處理的過程中丟失或者低含量難以被質(zhì)譜儀檢出。由圖1c可知，加入豬明膠后，所得多肽與豬皮多肽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊中分別檢測出12、16、11和16個(gè)豬明膠特征性多肽，其中有5個(gè)特征性多肽在4種阿膠塊中均能被檢出，因此可作為阿膠塊中追溯是否摻有豬明膠的依據(jù)。相應(yīng)地，4種阿膠塊中分別有7、11、6和11個(gè)非共有的豬明膠特征性多肽被檢出。在質(zhì)譜檢測中，氨基酸序列和修飾情況會(huì)影響多肽的檢出效果[25-26]，多肽的含量亦會(huì)影響其在質(zhì)譜圖中的信號(hào)強(qiáng)度[20]。此外，檢測實(shí)驗(yàn)前處理過程同樣可能對多肽產(chǎn)生影響，進(jìn)而干擾其質(zhì)譜檢測。上述因素均可能導(dǎo)致多肽只能在部分阿膠塊產(chǎn)品中被檢出，這些不能被穩(wěn)定檢出的特征性多肽用于阿膠塊中豬明膠的溯源具有較大風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)引起“假陰性”結(jié)果的出現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)牛明膠和豬明膠在阿膠塊中占比低時(shí)，依然可以在阿膠塊中穩(wěn)定地檢測出3個(gè)牛明膠特征性多肽和5個(gè)豬明膠特征性多肽。一般情況下，在質(zhì)譜峰中同時(shí)找到1種蛋白質(zhì)的2個(gè)多肽即可證明該蛋白質(zhì)的存在[27]。因此，上述結(jié)果說明HPLC-MS/MS能有效鑒別阿膠塊中低含量的牛明膠和豬明膠。

2.2 阿膠塊中阿膠的共有特征性多肽

研究不同品牌阿膠塊中阿膠的共有特征性多肽，有利于減少不同廠家制備工藝的差異對阿膠鑒定效果帶來的影響，這對阿膠塊的溯源鑒定十分重要。結(jié)合圖1a和表1可知，4種阿膠塊中阿膠的共有特征性多肽數(shù)目為18個(gè)，其中10個(gè)來自于α1鏈，8個(gè)來自于α2鏈。值得說明的是，在這些共有特征性多肽中，有3個(gè)多肽是不含修飾基團(tuán)的，分別是來自α1鏈的（R）1066GEAGPAGPAGPIGPVGAR1083（G）和（R）994GPPGPVGPPGLAGPPGESGR1013（E）以及來自于α2鏈的（R）1052GPAGPTGPVGK1062（D）。膠原蛋白含有大量的翻譯后修飾，使得明膠肽段的鑒定更為復(fù)雜，因此，在溯源鑒定中不帶修飾基團(tuán)的特征性多肽往往更受青睞，其在裂解過程中產(chǎn)生的碎片離子更容易被識(shí)別和匹配，能有效降低質(zhì)譜峰鑒定過程中的難度，提高多肽鑒定的準(zhǔn)確度[28-29]。

盡管翻譯后修飾大大增加了特征性多肽的鑒定難度，但由于其在特征性多肽總數(shù)中所占比例很大，特征性多肽修飾情況（尤其是脯氨酸（Pro）殘基上的羥基化修飾）的鑒定不容忽視。如表1所示，4種品牌阿膠中有15個(gè)共有特征性多肽（8個(gè)來自于α1鏈，7個(gè)來自于α2鏈）被鑒定出含有羥脯氨酸，在特征性多肽總數(shù)中占比83.3%。而且，脯氨酸殘基的羥基化修飾情況較為復(fù)雜，既有修飾基團(tuán)的數(shù)目不同，也有羥基化修飾位置的不同。例如，表1中有5個(gè)特征性多肽均來源于α1鏈的994GPPGPVGPPGLAGPP GESGR1013，m/z分 別 為900.95102+、892.95262+、892.95332+、884.95572+和876.95912+，包含的羥脯氨酸殘基數(shù)量分別為3、2、2、1和0個(gè)。由于多肽質(zhì)譜峰的價(jià)態(tài)為+2，所以每增加1個(gè)羥基化修飾意味著一級質(zhì)譜峰值增加8 Da。另外，m/z為892.95262+和892.95332+的特征性多肽雖然都含有2個(gè)被羥基化的脯氨酸殘基，但其修飾基團(tuán)所處的位置是不同，大大增加了阿膠溯源的難度。有報(bào)道指出，脯氨酸殘基的羥基化修飾引起的質(zhì)量改變可能和一些氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸）殘基的質(zhì)量差異較為接近，將對鑒定造成較大的干擾[29]。此時(shí)，高分辨率質(zhì)譜儀檢測是一種有效增強(qiáng)特征性多肽鑒定準(zhǔn)確度的手段。Kleinnijenhuis等[17]報(bào)道顯示，Orbitrap質(zhì)量分析器提供的高分辨率能有效區(qū)分羥脯氨酸和亮氨酸、異亮氨酸之間的細(xì)微差別。在本文中，采用的Orbitrap質(zhì)量分析器在一級質(zhì)譜峰m/z 200時(shí)分辨率能達(dá)到70000，在HCD二級質(zhì)譜圖中m/z 200時(shí)分辨率能達(dá)到17500，為準(zhǔn)確鑒定阿膠、牛明膠和豬明膠的特征性多肽提供了有利保障。

表1 阿膠的共有特征性多肽Table 1 Common characteristic peptides of donkey-hide gelatin

對于不同羥基化修飾水平，以5條來自阿膠共有特征性多肽片段994GPPGPVGPPGLAGPPGES GR1013為例，它們的相對分子質(zhì)量的實(shí)測值與理論值匹配度良好，誤差均小于5×10-6。5條阿膠共有特征性多肽二級質(zhì)譜如圖2所示。對于有羥基化修飾的位點(diǎn)，m/z為884.95572+峰值的肽段，通過y12-y11可證實(shí)Pro1002被羥基化（圖2b）；m/z為892.95262+的肽段，Pro995和Pro1008分別可通過y19-y18以及y6-y5被證實(shí)為羥脯氨酸殘基（圖2c）；m/z為892.95332+的肽段與m/z為892.95262+的肽段具有相同的羥基化修飾數(shù)量，但有不同的羥基化修飾位置，同理，y12-y11與y7-y6分別準(zhǔn)確地證實(shí)了Pro1002和Pro1007處的羥基化修飾（圖2d）。對于具有多個(gè)羥基化修飾位點(diǎn)的肽段，m/z為900.95102+峰值的肽段，y19-y18、y7-y6以及y6-y5準(zhǔn)確證實(shí)了Pro995、Pro1007和Pro1008被羥基化的情況（圖2e）。這說明HCD碎裂生成的MS/MS系列y離子和b離子能夠準(zhǔn)確證實(shí)這5條特征性多肽具有相同的氨基酸序列以及不同的羥基化修飾水平。

圖2 不同羥基化修飾水平的阿膠特征性多肽的質(zhì)譜鑒定Fig.2 Mass spectrometric identification of characteristic peptides of gelatin with different hydroxylated modification levels

2.3 阿膠塊中牛明膠的共有特征性多肽

當(dāng)阿膠中摻入了牛明膠時(shí)，在質(zhì)譜圖中將出現(xiàn)來源于牛明膠肽段的質(zhì)譜峰。若添加量較低，使用高分辨質(zhì)譜儀則能有效提高多肽的檢出率和準(zhǔn)確度。阿膠塊中加入低含量的牛明膠，經(jīng)過HPLC-MS/MS的檢測，同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊中分別鑒定出8、10、7和10個(gè)牛明膠特征性多肽，其中包含3個(gè)牛明膠的共有特征性多肽。如表2所示，特征性多肽序列和修飾情況的判別均來源于一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖的共同檢驗(yàn)，其中，1個(gè)共有特征性多肽來自α1鏈，2個(gè)共有特征性多肽則源自α2鏈，所有質(zhì)譜峰的誤差值均＜5×10-6，說明這3個(gè)共有特征性多肽鑒定的準(zhǔn)確度高，可用于阿膠塊產(chǎn)品中低含量牛明膠的鑒定分析。如上所述，未經(jīng)修飾的多肽片段在明膠鑒別中備受關(guān)注。由表2可知，在牛明膠的3個(gè)共有特征性多肽中有1個(gè)源自α1鏈的特征性多肽不包含任何修飾情況，其序列為1066GETGPAGPAGPIGPVGAR1083，m/z為780.91352+。這個(gè)特征性多肽在文獻(xiàn)中已多次被報(bào)道在牛明膠中檢出，如Kleinnijenhuis等[17]在豬明膠中摻入低含量的牛明膠，成功檢測出此特征性多肽并用于定量研究；Yilmaz等[28]將牛明膠摻入三種乳制品（酸奶、奶酪和冰淇淋）中，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢出了35條牛明膠特征性多肽，這條多肽包含其中；Grundy等[30]報(bào)道了14條牛明膠特征性多肽，其中含有這條特征多肽；課題組前期在純的牛明膠以及不同比例的牛明膠、豬明膠和阿膠的混合體系中，以及18O標(biāo)記定量檢測豬明膠和牛明膠的實(shí)驗(yàn)中也檢出了此特征性多肽[20,31]，表明其用于牛明膠的溯源鑒定中具有較高的穩(wěn)定性。

表2 牛明膠的共有特征性多肽Table 2 Common characteristic peptides of bovine gelatin

2.4 阿膠塊中豬明膠的共有特征性多肽

豬明膠是工業(yè)領(lǐng)域使用最多的食用明膠，同時(shí)在阿膠產(chǎn)品中也多次被曝光摻入了豬明膠[32-33]。因而，本文進(jìn)一步研究了阿膠塊中低含量豬明膠的特征性多肽。結(jié)合圖1c和表3可知，同仁堂阿膠塊、福牌阿膠塊、東阿阿膠塊和九芝堂阿膠塊中鑒定出的豬明膠特征性多肽比牛明膠特征性多肽數(shù)量更多，分別為12、16、11和16個(gè)，其中5個(gè)為阿膠塊中豬明膠的共有特征性多肽（1個(gè)共有特征性多肽是來自α1鏈，4個(gè)共有特征性多肽則源自α2鏈），其各個(gè)特征性多肽的誤差值均＜5×10-6，且均經(jīng)過一、二級質(zhì)譜的準(zhǔn)確判定，其可信度高，可用于阿膠塊產(chǎn)品中低含量豬明膠的鑒定分析。在上述5個(gè)豬明膠的共有特征性多肽中，有1個(gè)源自α1鏈的特征性多肽不包含任何修飾情況，其序列為1052GETGPAGPAGPVG PVGAR1069，m/z為773.90602+。同樣，此豬明膠特征性多肽多次被報(bào)道在純明膠或混合明膠中被檢出，如Yilmaz等[28]在乳制品中摻入豬明膠，結(jié)果檢出了54條豬明膠特征性多肽，其中包含這條特征性多肽；Grundy等[30]報(bào)道的5條豬明膠特征性多肽中亦含有這條特征多肽；同時(shí)，課題組在前期檢測純的豬明膠和混合明膠體系，以及18O標(biāo)記定量檢測豬明膠的特征性多肽的研究中也發(fā)現(xiàn)了這條特征多肽[20,22]，表明其穩(wěn)定性較高，在豬明膠的溯源中可發(fā)揮十分重要的作用。

表3 豬明膠的共有特征性多肽Table 3 Common characteristic peptides of porcine gelatin

綜合表1、表2和表3可知，如不考慮氨基酸殘基修飾的情況，從4種阿膠塊中檢出阿膠、牛明膠和豬明膠的共有特征性多肽片段數(shù)量分別為10、3、4個(gè)，其中來自α1鏈的數(shù)目分別為4、1、1個(gè)，來自α2鏈的數(shù)目分別為6、2、3個(gè)。以上結(jié)果表明，不論阿膠、牛明膠或是豬明膠，α2鏈檢出的特征性多肽片段均高于α1鏈，這主要是由于在驢皮、牛皮和豬皮膠原蛋白中，α2鏈的差異性大于α1鏈。前期研究表明，對于α1鏈，牛-豬、牛-驢和豬-驢膠原蛋白的相似度分別為95.9%、96.6%和95.3%；對于α2鏈，牛-豬、牛-驢和豬-驢膠原蛋白的相似度分別為95.3%、94.9%和94.7%[20]。因此，與α1鏈相比，稍高的差異使得α2鏈經(jīng)過明膠制備、酶解等工序后能游離出更多被質(zhì)譜檢測到的特征性多肽片段。

3 結(jié)論

本文以最受消費(fèi)者青睞的阿膠塊為原料，向其中分別加入低含量（1 mg/mL）的牛明膠和豬明膠，采用HPLC-MS/MS分別鑒定阿膠、牛明膠和豬明膠的特征性多肽。結(jié)果表明，不同品牌的阿膠塊產(chǎn)品被檢出的阿膠特征性多肽數(shù)目有所不同，其中18個(gè)特征性多肽為4種不同品牌阿膠塊的共有特征性多肽，對阿膠塊產(chǎn)品中阿膠成分的溯源鑒定具有十分重要的意義。當(dāng)加入低含量的牛明膠和豬明膠時(shí)，在阿膠塊中檢測出3個(gè)牛明膠的共有特征性多肽和5個(gè)豬明膠的共有特征性多肽，這些穩(wěn)定檢出的特征性多肽可作為阿膠塊中低含量牛明膠和豬明膠摻假的鑒定依據(jù)。該研究結(jié)果可為阿膠塊產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)管提供一定的理論依據(jù)。本文以阿膠塊為原料開展了摻假鑒定研究，然而，其他產(chǎn)品（如阿膠口服液、阿膠糕等）的明膠溯源鑒定同樣值得關(guān)注，后續(xù)將對其他類型的阿膠產(chǎn)品開展溯源研究，為阿膠產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。