基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討絞股藍(lán)防治肥胖的作用機(jī)制

蘇 瑤，王 蘭，常相娜，龔 頻，楊文娟，崔丹丹

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

肥胖癥（Obesity，OB）是指機(jī)體生理生化機(jī)能改變引起體內(nèi)脂肪沉積量過多，體重增加，并伴隨一系列病理變化的慢性代謝疾病。肥胖的誘因有多種，如家族遺傳、環(huán)境因素、內(nèi)分泌異常導(dǎo)致的低代謝率、一些藥物副作用及能量攝入與消耗的不平衡等[1]。隨著人民生活水平的提高，高能量、高脂肪的飲食習(xí)慣使得肥胖發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，而且研究顯示肥胖會顯著提高患心腦血管疾病、2型糖尿病、高血壓及癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]，肥胖癥已成為一個(gè)主要健康問題。由于脂肪組織是人體極其復(fù)雜且高度活躍的內(nèi)分泌組織，脂肪形成期間受多種激素、基因表達(dá)和信號通路的調(diào)控，涉及糖脂代謝異常、慢性炎癥以及誘發(fā)氧化等[3]病理機(jī)制，故有必要探究治療肥胖多靶點(diǎn)藥物。而中藥有著“多成分、多靶點(diǎn)”作用特點(diǎn)，并且市場上出現(xiàn)的降脂中藥如葛根，荷葉等[4]在肥胖治療中顯示出的良好療效大大提高了人們對中藥減肥的認(rèn)可度，使得中藥減肥藥及減肥功能食品的開發(fā)正逐漸成為一個(gè)重點(diǎn)發(fā)展方向。

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino），又名七葉膽、五葉參等，是葫蘆科絞股藍(lán)屬的多年生草質(zhì)藤本植物。據(jù)《本草綱目》記載，絞股藍(lán)有清熱解毒、益氣健脾、生津止渴和化濁降脂等之效[5]。現(xiàn)代藥理研究證明絞股藍(lán)具有抗疲勞、降血脂、降血壓、增強(qiáng)免疫等作用，在藥品、保健食品、畜牧業(yè)飼料添加及防疫中被廣泛應(yīng)用，是一種具有較大開發(fā)價(jià)值的藥食兩用植物資源[6]。在臨床癥狀中，肥胖病人多數(shù)有浮腫肢沉、神疲乏力、胸悶氣短、痰多喘促等癥狀，故中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾失健運(yùn)、濕痰、氣虛，是引起肥胖的主要因素[7]。而絞股藍(lán)有益氣、健脾、化濁功效，符合治療肥胖特點(diǎn)。并且現(xiàn)代研究表明絞股藍(lán)中多種成分有降脂活性，如絞股藍(lán)皂苷可通過改變膽固醇膠束結(jié)構(gòu)降低腸道對膽固醇的吸收[8]，減少脂肪酶與脂質(zhì)底物的親和力，促進(jìn)膽汁酸的合成與分泌促進(jìn)脂質(zhì)代謝[9]；絞股藍(lán)黃酮可通過抑制脂肪前體細(xì)胞和肝細(xì)胞等的成脂過程[10]，調(diào)節(jié)慢性炎癥引起的脂肪代謝紊亂[11]，促進(jìn)膽固醇的外排及膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化[12]等；絞股藍(lán)多糖可調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)，降低胰島素抵抗作用[13]等達(dá)到調(diào)節(jié)脂肪代謝。故利用絞股藍(lán)化學(xué)成分及作用途徑多樣特點(diǎn)，可將其作為潛在抑制肥胖多靶點(diǎn)藥物。但另一方面，在絞股藍(lán)降脂機(jī)制探究中，上述活性成分藥理研究多依賴于某一降脂指標(biāo)、單一通路或靶點(diǎn)進(jìn)行探究，缺乏對絞股藍(lán)多靶點(diǎn)、多通路防治肥胖的整體認(rèn)識和各機(jī)制間協(xié)同作用系統(tǒng)性分析，而且使用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法系統(tǒng)全面檢測出絞股藍(lán)的減肥降脂機(jī)制過程漫長且復(fù)雜，因此有必要探索新方法來闡明絞股藍(lán)降脂作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)和系統(tǒng)藥理學(xué)為一體的新興學(xué)科[14]。其疾病與化合藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)全局化、系統(tǒng)化思路與中醫(yī)的整體觀念一脈相通，已成為中藥研究的一種有效技術(shù)手段，如：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹參治療微循環(huán)障礙[15]，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃芪治療糖尿病腎病[16]等諸多報(bào)道對中藥治療疾病提供了方向。因此，為針對性研究絞股藍(lán)防治肥胖主要藥效成分及作用機(jī)制間關(guān)系，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“中藥活性成分-靶點(diǎn)”、蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)、靶基因功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合分子對接技術(shù)系統(tǒng)分析絞股藍(lán)抑制肥胖的物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在降脂靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為絞股藍(lán)防治肥胖方向的基礎(chǔ)研究及后續(xù)應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）；OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）；Drug-Bank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.com）；STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org）；David數(shù)據(jù)庫（https://david.abcc.ncifcrf.gov）；Cytoscape3.7.2軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絞股藍(lán)活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索關(guān)鍵詞“絞股藍(lán)”，得到其活性成分信息。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL），篩選出同時(shí)滿足OB≥20%和DL≥0.1的化學(xué)成分[17]，并結(jié)合文獻(xiàn)[18-20]報(bào)道的成分，整理得到絞股藍(lán)活性成分。

1.2.2 活性成分與肥胖交集靶點(diǎn)篩選及成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載每個(gè)活性成分的Smiles化學(xué)式，上傳到Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）平臺，以“人類”為研究物種收集靶點(diǎn)，整理得絞股藍(lán)活性成分作用靶點(diǎn)。

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM數(shù) 據(jù) 庫（https://www.omim.org/）、DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.com），輸入關(guān)鍵詞“obesity”，可得與肥胖相關(guān)靶點(diǎn)，合并3大數(shù)據(jù)庫肥胖靶點(diǎn)，去除重復(fù)基因和假陽性基因得肥胖靶點(diǎn)。將收集到的肥胖靶點(diǎn)與絞股藍(lán)活性成分靶點(diǎn)匹配，其中共同靶點(diǎn)即為絞股藍(lán)潛在抑制肥胖作用靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建絞股藍(lán)活性成分-肥胖作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將絞股藍(lán)的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org），參考文獻(xiàn)方法參數(shù)設(shè)置[21-22]，并以P＜0.01為顯著臨界值得蛋白相互作用關(guān)系。將篩選后分析文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，將蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（proteinprotein interaction，PPI）可視化。

1.2.4 分子對接驗(yàn)證 從PDB數(shù)據(jù)庫下載上述PPI網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，通過加氫準(zhǔn)備、賦予CHARMm力場后，定義原激酶域的ATP活性位點(diǎn)為對接口袋。選取有核心靶點(diǎn)化合物進(jìn)入3D模式運(yùn)行能量最小化計(jì)算，之后導(dǎo)入Discovery studio 3.5的CDocker模塊進(jìn)行柔性分子對接。運(yùn)行結(jié)束后分析化合物與蛋白的對接模式。評價(jià)絞股藍(lán)活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，并且篩選出潛在主要藥效化合物。

1.2.5 生物過程與通路分析 通過David數(shù)據(jù)庫（https://david.abcc.ncifcrf.gov）對絞股藍(lán)抑制肥胖靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene Ontology，基因本體）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）通路分析，按關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)目由高到低排序，并以P＜0.01作為明顯功能與通路的界定值，選取排名前10通路。

1.2.6 絞股藍(lán)防治肥胖成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步研究成分、靶點(diǎn)與信號通路之間的相互作用關(guān)系，利用Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建絞股藍(lán)降脂成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖及靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)活性成分篩選

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中OB≥20%和DL≥0.10的標(biāo)準(zhǔn)篩選后，共有59種活性化合物，連同文獻(xiàn)報(bào)道的活性成分5種，共64種，具體信息見表1。

表1 絞股藍(lán)活性成分信息Table 1 Active ingredient information of Gynostemma pentaphyllum

續(xù)表 1

2.2 絞股藍(lán)抑制肥胖潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測及絞股藍(lán)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述64個(gè)絞股藍(lán)活性成分在Swiss Target Prediction平臺中檢索得到的作用靶點(diǎn)整合，得到作用靶點(diǎn)291個(gè)。從GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索整合得到肥胖靶點(diǎn)1419個(gè)，絞股藍(lán)活性成分作用靶點(diǎn)與肥胖靶點(diǎn)交集共有107個(gè)，如圖1所示。將活性成分與肥胖交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化后，得絞股藍(lán)-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示。圖中矩形表示活性成分與疾病交集靶點(diǎn)，圓形表示絞股藍(lán)活性成分，圖形面積越大代表其潛在活性靶點(diǎn)越多。由圖2可以看出絞股藍(lán)抑制肥胖活性成分共16種，有槲皮素（quercetin）、蘆丁（rutin）、人參皂苷f2（ginsenoside f2）、絞股藍(lán)皂苷XXVIII（Gypenoside XXVIII）、3'-甲基柔二醇（3'-methyleriodictyol）、3-甲基鼠李素（Rhamnazin）、谷甾醇（sitosterol）、黃夾次甙丙（Ruvoside）、a-菠菜甾醇（Spinasterol）、菜油甾醇（campesterol）、異氟固醇（Isofucosterol）、膽甾醇（CLR）、絞股藍(lán)皂苷XLIX（Gypenoside XLIX）、脂凝素（Gypsogenin）、亞油酸（EIC）、油酰胺（ELD）。

圖1 絞股藍(lán)活性成分靶點(diǎn)和肥胖靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of intersection genes of active ingredient related targets of Gynostemma pentaphyllum and anti-obesity targets

圖2 絞股藍(lán)-活性成分-肥胖作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Active ingredients of Gynostemma pentaphyllum anti-obesity target network

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將107個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至STRING11.0，經(jīng)規(guī)范后得到靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），詳細(xì)見圖3。圖中圓圈代表該基因度值，圓圈越小Degree值越小，連線越粗Combined score值越大。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)將靶點(diǎn)按照度值由高到低排序，結(jié)果顯示共有107個(gè)節(jié)點(diǎn)，419條邊，平均度值是7.83，其中超過平均度值的靶點(diǎn)有38個(gè)，推測這38個(gè)靶點(diǎn)為絞股藍(lán)作用于肥胖的關(guān)鍵靶點(diǎn)。由這38個(gè)靶點(diǎn)可知絞股藍(lán)在防治肥胖過程中有轉(zhuǎn)錄因子、信號分子、受體、蛋白（轉(zhuǎn)移/載體蛋白）、酶（激酶、轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶）等多種物質(zhì)的參與。其中STAT3、SRC、EGFR、AKT1、MAPK3、VEGFA的節(jié)點(diǎn)度值排名前六位，推測這些靶點(diǎn)可能是治療肥胖的核心靶點(diǎn)。

圖3 絞股藍(lán)治療肥胖作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein interaction network of Gynostemma pentaphyllum anti-obesity

2.4 分子對接驗(yàn)證結(jié)果

選取PPI中度值前6位靶點(diǎn)與有這6個(gè)靶點(diǎn)的化合物進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。表2為活性成分與相對應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)信息，由表可知3'-甲基柔二醇（3'-methyleriodictyol）、3-甲基鼠李素（Rhamnazin）、黃夾次甙丙（Ruvoside）、槲皮素（quercetin）、人參皂苷f2（ginsenoside f2）、絞股藍(lán)皂苷XXVIII（Gypenoside XXVIII）、a-菠菜甾醇（Spinastero）、膽甾醇（CLR）8個(gè)化合物有對應(yīng)核心靶點(diǎn)，推測這8個(gè)化合物可能是絞股藍(lán)抑制肥胖關(guān)鍵藥效成分。在對接中，小分子與靶點(diǎn)蛋白相互作用能量打分＜0表示有一定結(jié)合作用，相互作用能量打分＜-30表示有較強(qiáng)結(jié)合作用[23]。由表3可知蛋白與化合物對接相互作用能量分?jǐn)?shù)在-22.8832～-49.6606，表明這8個(gè)化合物與對應(yīng)核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)合普遍較好，提示本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)與結(jié)果較為可靠，具有較高的參考價(jià)值。圖4為8個(gè)化合物與肥胖核心靶點(diǎn)的分子對接模式圖。

圖4 絞股藍(lán)8個(gè)化合物與對應(yīng)肥胖核心靶點(diǎn)的分子對接模式圖Fig.4 Molecular docking patterns of eight Gynostemma pentaphyllum compounds with key obesity targets

表2 各活性成分對應(yīng)防治肥胖關(guān)鍵靶點(diǎn)基因Table 2 Corresponding gene of each active ingredient

表3 絞股藍(lán)關(guān)鍵成分與對應(yīng)核心靶點(diǎn)相互作用能量打分表Table 3 Key components and the corresponding core target interaction energy score table

2.5 GO和KEGG富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，各過程富集排名前10位分析結(jié)果詳細(xì)見圖5（P＜0.01），圖中X軸代表靶基因中屬于該過程的基因數(shù)量，Y軸3種顏色代表生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular components，CC）、分子功能（Molecular function，MF）。圖5結(jié)果顯示絞股藍(lán)抑制肥胖靶點(diǎn)參與的生物過程包括細(xì)胞生長增殖過程、代謝過程、激素調(diào)節(jié)過程等，如RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正/負(fù)調(diào)控（positive/negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、DNA模板轉(zhuǎn)錄調(diào)控（transcription, DNA-templated）、信號傳導(dǎo)（signal transduction）、凋亡過程的正/負(fù)調(diào)控（positive/negative regulation of apoptotic process）、蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）、氧化還原過程（oxidation-reduction process）、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路（steroid hormone mediated signaling pathway）等；參與的細(xì)胞組成主要包括核（nucleus）、質(zhì)膜（plasma membrane）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、胞質(zhì)溶膠（cytosol）、核質(zhì)（nucleoplasm）、細(xì)胞外泌體（extracellular exosome）、線粒體（mitochondrion）等；分子功能主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、鋅離子結(jié)合（zinc ion binding）、ATP結(jié)合（ATP binding）、轉(zhuǎn)錄因子活性序列特異性DNA結(jié)合（transcription factor activity, sequence-specific DNA binding）、DNA結(jié)合（DNA binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）等。

圖5 絞股藍(lán)防治肥胖基因GO富集分析結(jié)果Fig.5 Gynostemma pentaphyllum prevention and treatment of obesity gene GO enrichment analysis diagram

KEGG通路分析結(jié)果詳見圖6，圖中氣泡顏色代表富集顯著性（P-value）的大小；氣泡大小代表目標(biāo)基因集中屬于該pathway的基因數(shù)量。表4為KEGG富集排名前10通路信息表（P＜0.01）。由圖表可知絞股藍(lán)治療肥胖的靶點(diǎn)主要集中在癌癥信號通路、癌癥中蛋白多糖信號通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、HIF-1信號通路等。

表4 絞股藍(lán)防治肥胖KEGG通路排名前10位富集分析Table 4 Enrichment analysis of the top 10 KEGG pathways

圖6 絞股藍(lán)活性成分防治肥胖的KEGG通路富集氣泡圖Fig.6 KEGG pathway enrichment bubble chart of the active ingredients of Gynostemma pentaphyllum preventing and treating obesity

2.6 絞股藍(lán)降脂成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進(jìn)一步研究成分、靶點(diǎn)與信號通路之間的相互作用關(guān)系，將分子對接中篩選的8個(gè)潛在降脂關(guān)鍵藥效成分、38個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)及排名前10的作用通路采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，詳細(xì)見圖7，圖中藍(lán)色圓形表示降脂成分，綠色矩形表示作用靶點(diǎn)，橙色三角形表示作用通路，圖內(nèi)連線表示各點(diǎn)之間的相互關(guān)系。由圖7可得絞股藍(lán)治療肥胖有多個(gè)成分作用于同一靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)調(diào)節(jié)多個(gè)信號通路，體現(xiàn)出絞股藍(lán)多成分、多靶點(diǎn)及多種作用通路協(xié)同防治肥胖。

圖7 絞股藍(lán)防治肥胖成分-靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)路圖Fig.7 Gynostemma pentaphyllum prevents obesity components-target-action pathway network diagram

使用KEGG數(shù)據(jù)庫搜索靠前信號通路，聯(lián)合Cell Signaling數(shù)據(jù)庫，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，詳細(xì)見圖8。由圖可知，絞股藍(lán)可通過多個(gè)信號通路協(xié)同治療肥胖，各通路間存在上下游關(guān)系，各靶點(diǎn)間存在相互作用關(guān)系。通過靶點(diǎn)與通路間網(wǎng)絡(luò)，絞股藍(lán)可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活、代謝等途徑起到防治肥胖作用。如圖中HIF-1通路受上游通路PI3K-Akt通路、STAT3通路調(diào)控，在這3條通路中絞股藍(lán)防治肥胖靶點(diǎn)AKT1、STAT3、HIF-1處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，通過3條通路上靶點(diǎn)在細(xì)胞間、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)的相互作用，調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化、代謝等過程。

圖8 絞股藍(lán)防治肥胖靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 Interaction network diagram of Gynostemma pentaphyllum preventing and treating obesity targets

3 討論

本研究篩選出絞股藍(lán)中16個(gè)活性成分有對應(yīng)肥胖靶標(biāo)，這16個(gè)活性成分可能為絞股藍(lán)防治肥胖物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)合篩選出的核心靶點(diǎn)蛋白與對應(yīng)化合物分子對接結(jié)合良好，分析出槲皮素、人參皂苷f2、絞股藍(lán)皂苷XXVIII、3'-甲基柔二醇、黃夾次甙丙、3-甲基鼠李素、a-菠菜甾醇、膽甾醇8個(gè)化合物可能為防治肥胖關(guān)鍵藥效成分。同時(shí)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果顯示，如槲皮素可明顯改善糖尿病肥胖大鼠體內(nèi)的總膽固醇含量及體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]，可調(diào)節(jié)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中轉(zhuǎn)導(dǎo)因子ERK1/2、JNK、P38MAPK、MCP-1及TNF-α表達(dá)量來抑制肥胖，還可提高脂肪組織中UCP1（內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白1）水平來增加能量消耗，并在肥胖引起的炎癥中，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6和刺激抗炎因子IL-10的分泌，達(dá)到防治肥胖目的[25]。人參皂苷f2可抑制脂肪生成標(biāo)記物PPARγ表達(dá)進(jìn)而阻止脂肪細(xì)胞分化起到降脂作用[26]。蘆丁可抑制PPARγ和C/EBPα等成脂轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)進(jìn)而干擾脂肪前體細(xì)胞和肝細(xì)胞等的成脂過程[27]，故本研究篩選結(jié)果有一定理論依據(jù)，可為絞股藍(lán)治療肥胖的藥效成分研究提供方向。

藥物靶點(diǎn)的預(yù)測揭示了藥物與分子作用機(jī)制重要信息，對促進(jìn)藥物研發(fā)有著重要意義。在對絞股藍(lán)降脂靶點(diǎn)篩選中，通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出節(jié)點(diǎn)相關(guān)性最強(qiáng)的靶點(diǎn)有AKT1、STAT3、VEGFA、SRC、EGFR、MAPK3。其中，AKT激酶是在脂肪細(xì)胞中具有關(guān)鍵體內(nèi)功能的胰島素效應(yīng)器，可刺激葡萄糖攝取和糖原合成，以及蛋白質(zhì)合成[28]。AKT1是AKT主要亞型之一，可介導(dǎo)胰島素、IGF-1、IL-3以及其他生長因子的多種代謝、促有絲分裂和抗凋亡作用，是參與脂肪形成的重要致病因子[29]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)已證明AKT1可增加CDK2（AKT磷酸化周期蛋白依賴性激酶）的活性使得3T3-L1細(xì)胞的生長周期變快影響其增殖和生長[30]；STAT3是一種信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白，屬于與DNA結(jié)合的STAT蛋白質(zhì)家族。在機(jī)體內(nèi)，白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)化對于改善肥胖具有重要意義[31]，而STAT3作為減肥作用靶點(diǎn)時(shí)，STAT3能夠進(jìn)入線粒體，調(diào)節(jié)電子傳遞鏈，增加線粒體ATP生成，進(jìn)而促進(jìn)棕色脂肪生成，調(diào)節(jié)能量以維持正常能量穩(wěn)態(tài)[32]。并且有研究報(bào)道STAT3可作為直接靶標(biāo)通過調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)基因影響脂肪細(xì)胞增殖和分化[33]。VEGFA在脂肪發(fā)育和能量代謝中起重要調(diào)節(jié)作用。VEGFA屬于VEGF家族，參與血管形成、調(diào)節(jié)血管通透性、維持血管生理功能等過程。而VEGFA與調(diào)節(jié)機(jī)體肥胖也有直接關(guān)系，脂肪組織會刺激內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)大產(chǎn)生VEGFA，進(jìn)而促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成，隨后機(jī)體通過提高血清瘦素水平去控制血管生成，對抗脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的積累[34]。在篩選的核心靶點(diǎn)中，SRC（非受體酪氨酸激酶）、EGFR（表皮生長因子受體）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）這3個(gè)靶點(diǎn)可參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活，且主要集中在癌癥機(jī)制研究中[35]。文獻(xiàn)顯示癌細(xì)胞通常被大量脂肪細(xì)胞包圍，這些脂肪細(xì)胞會產(chǎn)生富含脂肪酸的環(huán)境作為癌細(xì)胞生長的外部刺激，使得癌細(xì)胞對葡萄糖和谷氨酰胺異常高需求，繼而表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝的改變即脂肪生成增加、脂肪酸攝取增加[36]，因此篩選出這三個(gè)靶點(diǎn)有可能是其影響了癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝。通過上述文獻(xiàn)調(diào)研可得絞股藍(lán)的靶點(diǎn)篩選與目前大量藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相吻合，后期可根據(jù)預(yù)測結(jié)果進(jìn)一步探究藥效成分與靶點(diǎn)作用關(guān)系。

在絞股藍(lán)治療肥胖的分子機(jī)制中，KEGG分析得富集靶點(diǎn)較多并且顯著性較高的為癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、HIF-1信號通路等。在肥胖發(fā)展過程中，細(xì)胞水平上表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞數(shù)目增多、體積增大，這些變化導(dǎo)致脂質(zhì)在脂肪組織中過量積累。而在腫瘤的發(fā)展過程中，機(jī)體同樣發(fā)生增殖過度，期間腫瘤細(xì)胞增加促進(jìn)生長的信號因子，改變對生長抑制提示的反應(yīng)，下調(diào)保護(hù)性凋亡機(jī)制，增強(qiáng)腫瘤灌注和不受控制的復(fù)制遺傳物質(zhì)的能力等最終導(dǎo)致細(xì)胞無限制、無序增殖、組織侵襲和轉(zhuǎn)移[37]。結(jié)合前面PPI篩選絞股藍(lán)防治肥胖關(guān)鍵靶點(diǎn)，推測絞股藍(lán)可能是通過調(diào)控如STAT3、AKT1、EGFR、VEGFA等靶點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的過程，達(dá)到抑制脂肪細(xì)胞不受控制分化、增殖目的。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是介導(dǎo)代謝和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，確保細(xì)胞功能完整性的中心樞紐。而蛋白多糖是胞外基質(zhì)的重要組成部分，在胚胎發(fā)生、組織修復(fù)、炎癥和癌癥相關(guān)的信號通路中起到關(guān)鍵角色[38]。其中炎癥與肥胖的相關(guān)性已得到廣泛認(rèn)可，尤其是中樞性肥胖，內(nèi)臟脂肪的過度沉積與血清促炎細(xì)胞因子如IL-6、CRP、TNF水平升高有關(guān)[39]。故推測絞股藍(lán)中活性成分可能通過癌癥蛋白多糖通路影響由肥胖引起的慢性炎癥的發(fā)展。PI3K-Akt信號通路在脂肪形成中影響脂肪細(xì)胞增殖，并且是調(diào)控血糖平衡的重要通路[40]。在該通路中PI3K激活后，在磷酸肌醇依賴性激酶的幫助下，導(dǎo)致Akt結(jié)合到細(xì)胞膜上，緊接著PI3K-Akt通過磷酸化糖原合酶激酶3β的N端絲氨酸來抑制糖原合酶激酶3β的活性增加細(xì)胞周期蛋白D1的積累，導(dǎo)致糖原的合成減少，增加糖酵解，促進(jìn)葡萄糖攝入細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)脂肪合成，故推斷絞股藍(lán)中活性成分可能通過抑制該通路影響機(jī)體糖脂代謝[41]。Rap1信號通路在PI3KAkt通路上游，其中Rap1在各種代謝和信號通路中作為基因表達(dá)的分子決定因素，Rap1缺乏可導(dǎo)致多系統(tǒng)代謝紊亂，表現(xiàn)為葡萄糖不耐受、血脂異常、肝臟脂肪變性和過量脂肪堆積[42]。在PI3K-Akt通路下游mTOR靶向蛋白是細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，其通過PI3K-Akt或Ras-ERK信號通路接收生長因子、營養(yǎng)、能量等多種信號促進(jìn)細(xì)胞生長增殖，而對mTOR信號通路的抑制可以使細(xì)胞停滯在G1期而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。在肥胖相關(guān)研究中，有文獻(xiàn)報(bào)道藥物可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt-mTOR信號通路，顯著降低脂肪生成標(biāo)記PPARγ、FASN和FABP4的表達(dá)水平，抑制前脂肪細(xì)胞增殖和分化[43]。由此結(jié)合KEGG分析推測絞股藍(lán)活性成分很可能通過Rap1通路及PI3K-Akt-mTOR通路調(diào)控細(xì)胞增殖、生長及生成脂質(zhì)基因發(fā)揮防治肥胖作用。在KEGG分析中胰島素抵抗通路排第五位，病理研究顯示肥胖會通過誘導(dǎo)胰島素抵抗來增加2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，且由于機(jī)體能量代謝不平衡，脂肪細(xì)胞變大，增生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙等，使得炎性因子水平升高，機(jī)體呈現(xiàn)一種慢性炎性反應(yīng)進(jìn)而影響全身各器官[44]。由此推測絞股藍(lán)活性成分可能通過胰島素抵抗通路影響機(jī)體糖脂代謝及炎癥因子分泌達(dá)到防治肥胖作用。在KEGG分析中HIF-1信號通路顯著性也較高，其中絞股藍(lán)降脂靶點(diǎn)HIF-α處在PI3K-Akt-mTOR通路和STAT3通路下游，其蛋白水平受PI3K-AktmTOR和STAT3調(diào)節(jié)[45]，同時(shí)HIF-α也可調(diào)控眾多下游基因，包括血管生成基因（VEGF），紅細(xì)胞生成和能量代謝基因（GLUT1，ALDOA，ENO1，LDHA，PFK2，PGK1和HK），細(xì)胞增殖和分化基因（FGFs，TGF和IGF）。在肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞可通過增加HIF-α來控制線粒體的生物發(fā)生和糖酵解，增加胰島素抵抗來控制脂肪細(xì)胞消耗氧氣維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[46]。因此如果絞股藍(lán)中活性成分通過HIF-1通路激活HIF-α將是治療肥胖和胰島素抵抗的重要藥物研發(fā)方向。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)對絞股藍(lán)防治肥胖的活性成分、潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測分析，闡述了絞股藍(lán)通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用，影響機(jī)體脂肪細(xì)胞增殖分化、脂質(zhì)基因表達(dá)、糖脂代謝及機(jī)體炎癥等發(fā)揮療效，為后續(xù)更深層次的挖掘絞股藍(lán)防治肥胖機(jī)制及絞股藍(lán)藥物的開發(fā)利用提供了新思路和方向。