腦膠質瘤液體活檢技術研發和臨床應用

亓彥華 薛皓 李剛

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，尤其是惡性程度最高的膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)，復發率和病死率極高，其中位生存期約14個月，是青壯年首位腫瘤死因，被稱為“新癌王”[1]。絕大部分腦膠質瘤早期不易發現，往往在出現癥狀之后才能確診。傳統的診斷技術包括顱腦影像學檢查和病變組織活檢，但兩者均有一定的局限性。液體活檢(liquid biopsy)方便、快捷、非侵入性、可多次取樣，更符合當下腫瘤精準診療的趨勢。因此，研究適合腦膠質瘤的早期液體活檢策略，篩選腦膠質瘤特異性液體活檢腫瘤標志物，尤其是早期診斷和復發監測的標志物，是實現其精準診療的重要手段。

一、腦膠質瘤傳統檢查方法的局限性

顱腦影像學檢查主要包括磁共振技術 (MRI) 、磁共振波譜分析 (MRS) 、SPET-CT、PET-CT等，在腦膠質瘤診斷和復發監測中發揮了重要作用，但對于影像學表現不典型或早期的腦膠質瘤病人診斷特異性較差。有研究表明，腫瘤細胞大小一般在10 μm數量級上，而MRI空間分辨率只能達到2～3 mm，因此，當MRI檢測到腫瘤時，腫瘤細胞已經經歷了二十多輪指數增長，這使得一些微小的腫瘤原發灶和復發灶難以被及時發現，最終錯過最佳治療時機[2-3]。此外，腦膠質瘤在治療過程中，放、化療會破壞血腦屏障，導致MRI掃描的對比度增加，被稱為假性進展；相反，一些抗血管生成藥物的使用會導致MRI掃描的對比度降低，被稱為假性消退，這兩者僅僅通過影像學檢查都難以鑒別區分，可影響診斷的準確性，從而導致病人進行不必要的重復手術[4]。

病變組織活檢是目前腦膠質瘤診斷的“金標準”。病變活檢是一種侵入性檢查手段，有穿刺后出血、癲癇發作、腫瘤轉移等風險，不適合反復多次檢查；此外，由于腦膠質瘤存在異質性，不同部位的腫瘤性質往往有一定區別，導致取出的少量組織不能完全反映腫瘤整體情況，診斷有一定偏差[5]。另外，對于腦干、丘腦等重要部位的腫瘤，組織獲取風險高，操作難度大，也不利于檢查的進行。液體活檢作為一種新興的檢查手段，具有方便、非侵入性、可反復取樣、動態監測等特點，可以有效彌補這些傳統檢查手段的短板，雖然目前研究還不夠成熟和深入，但值得進一步探索。

二、液體活檢在腦膠質瘤中的應用

液體活檢是對影像學難以判斷的腦膠質瘤的一種輔助診斷方法，可以避免穿刺活檢的風險并提高病變的早期確診率。腦膠質瘤可以釋放各種分子來調控細胞間的信號傳導及代謝催化途徑，這些分子可以通過循環到達體液，可以作為液體活檢的標志物被分離和檢測出來，用于腦膠質瘤的早期診斷和預后評估[6]。循環腫瘤細胞(circulating Ttumor cell，CTC)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ct-DNA)和蛋白質被認為是腦膠質瘤早期診斷和實時監測的標志物，CTC是指從實體腫瘤脫落進入外周循環系統的腫瘤細胞，它保留了來自原發腫瘤的特定分子特征，可以用于對原發腫瘤進行臨床診斷，但目前針對腦膠質瘤CTC研究不多，樣本量也少，并且每個研究分離CTC的方法不同，使得研究結果不具有可比性。此外，CTC在腦膠質瘤病人體液中的含量遠遠低于正常細胞，10 ml血液中只能發現一個或幾個腫瘤細胞，而且純度較低，難以反映整個腦膠質瘤的真實情況[7]。因此，只有開發具有更高靈敏度的CTC檢測手段才有可能應用于臨床[8]。ct-DNA是一種存在于血漿、腦脊液等體液中的細胞外DNA，主要來自于壞死或凋亡的腫瘤細胞及循環腫瘤細胞。血漿 ct-DNA 的液體活檢已在許多實體腫瘤中進行了廣泛研究，可以用于腫瘤負荷和突變的跟蹤檢測[9-10]；由于血腦屏障的存在，腦膠質瘤ct-DNA在血液中含量極低，只在少數病人中可檢測到。因此，腦脊液成為腦膠質瘤ct-DNA分離提取的最佳來源，但目前針對腦脊液ct-DNA的檢測仍存在許多問題。有研究表明，低級別腦膠質瘤(lower grade glioma，LGG)生長速度緩慢，只有少數LGG釋放到腦脊液中的ct-DNA可以被檢測到；位于腦實質中的膠質瘤不與腦脊液相鄰，它們的ct-DNA檢測率也很低[7,11]。此外，ct-DNA 在分析前和分析階段對環境的要求也非常苛刻，使得檢測的穩定性難以保證，導致臨床應用遇到諸多困難。

近年來，外泌體引起了越來越多的關注，已成為腫瘤液體活檢的重要選擇。外泌體是直徑為30～150 nm的細胞外囊泡，包含核酸(DNA，RNA，microRNA等)、蛋白質(膜受體、配體、細胞因子等)、脂質和一些代謝產物，參與腫瘤細胞間的信息傳遞及免疫微環境的形成[11-12]。研究證實，腦膠質瘤細胞分泌的外泌體可以調節其他腫瘤細胞和正常組織細胞(星形膠質細胞、小膠質細胞、T細胞等)，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲遷移，誘導血管生成，調節代謝活動，引起免疫抑制，影響藥物耐受[13-14]。由于外泌體來自整個腫瘤組織細胞，所以可以包含更加豐富的信息，反映腫瘤整體狀況，更加準確地對腦膠質瘤進行診斷及預后評估。與游離的核酸及蛋白質相比，外泌體包裹的生物大分子可以避免體液中循環的核酸酶及蛋白酶的降解，因此，針對外泌體進行檢測，穩定性和敏感度要優于CTCs和ct-DNA等[15-16]。基于以上特點，外泌體有可能成為腦膠質瘤液體活檢的首要選擇，針對腦膠質瘤異質性和突變性強的特點為病人提供個體化的診療方案。

三、腦脊液中膠質瘤相關外泌體在液體活檢中的應用

血液和腦脊液是提取膠質瘤外泌體的兩個最主要來源，腦膠質瘤外泌體具有穿透血腦屏障的能力，可以在外周血中被檢測到。幾乎所有器官的外泌體都可以進入血液，致使血液中的外泌體成分極為復雜[17]，使得血液中膠質瘤外泌體的分離和純化難度很大，導致提取的外泌體成分不純，診斷的準確性大大降低。腦脊液是一個相對封閉的環境，可以通過血腦屏障阻擋其它來源的外泌體，減少中樞神經系統之外的干擾，大大提高了膠質瘤外泌體的純度，增加了診斷的準確性。在臨床中，主要是通過腰椎穿刺術獲取腦脊液，這雖是一種有創性的檢查方式，即將穿刺針插入椎管的蛛網膜下腔來獲取樣本，這會給病人造成疼痛并伴有感染風險，但仍被認為是一種相對安全的操作。腦脊液目前被認為是腦膠質瘤液體活檢的首要選擇。

膠質瘤腦脊液外泌體液體活檢在臨床上主要用于檢測一些特定分子的變化，包括EGFRvⅢ、IDH1突變蛋白或miRNA。有研究表明，在對71例GBM病人的多中心研究中，檢測腦脊液外泌體中EGFRvⅢ的特異性高達98%，但敏感性較低，小于61%[18]。IDH1的突變轉錄本也可以在膠質瘤病人的腦脊液外泌體中被檢測到，敏感度為62.5%，特異度高達100%，但在血清外泌體中未檢測到[19]。miRNA是一類小非編碼RNA，可以在轉錄后水平調節基因的表達，與腦膠質瘤的發生發展密切相關[20]。越來越多的研究證明，膠質瘤病人的腦脊液外泌體中存在上調或下調的miRNA，這些miRNA可以作為生物標志物用于診斷。miR-21已經被證明可以作為GBM的候選診斷標志物，GBM病人腦脊液分離的外泌體中miR-21的水平是正常對照組的10倍，且術后腦脊液外泌體中miR-21的含量明顯下降[21]。多個miRNA的臨床預測模型可提高診斷的敏感性和特異性。外泌體miR-21可以區分腦膠質瘤病人和健康對照，但是不能區分高級別膠質瘤和腦轉移瘤，當結合miR-21、miR-222和miR-124-3p進行檢測時，可以進行兩者的區別診斷[22]。

我們團隊通過對59例腦膠質瘤病人腫瘤組織樣本及其腦脊液外泌體進行全轉錄組測序，分析了液體活檢中所有的RNA分子，包括miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA，證實只有miRNA可以作為液體活檢的檢測標志物。已有關于腦膠質瘤調控外泌體miRNA外排機制的相關報道。研究認為，外泌體可作為腫瘤促進分子的載體將促癌的miRNA傳遞給其他的腫瘤細胞和免疫微環境中的免疫細胞，從而促進腫瘤細胞的惡性進展[23-25]。近期，我們課題組研究發現，腦膠質瘤可以通過將抑癌miRNA分選到外泌體內，排出腫瘤細胞起到促癌的作用；并可通過將這些抑癌miRNA利用外泌體靶向運載至腫瘤微環境中的抑制性髓系免疫細胞(腫瘤相關巨噬細胞TAMs或髓系抑制細胞MDSCs)，發揮促進腫瘤免疫微環境惡化的作用，起到雙重促腫瘤作用，我們團隊在國內外首次提出這一理論，相關研究成果已在國際權威雜志上進行發表[26-27]。

基于此測序結果我們建成了首個多中心腦膠質瘤全組學液體活檢大數據隊列(臨床注冊研究ChiCTR2000032547)及液體活檢在線數據庫BrainLiquid和腦膠質瘤腦脊液外泌體數據庫CEGA(China Exo-glioma Genomics Atlas)，并配套完成了類器官標本庫的構建工作，數據庫做到了“全病程、全標本、全組學”覆蓋。在前期的小規模隊列研究中，我們發現基于腦脊液外泌體miRNA的GBM復發監測策略，不僅能夠顯著提高早期復發病灶的檢出率，還能將傳統影像學診斷復發的時間窗提前約6個月。為了進一步提高腦脊液外泌體miRNA檢測的便捷性，我們又聯合交叉學科團隊研發了基因床旁快速診斷設備，通過微流控芯片實現外泌體腫瘤分子標志物檢測，開展并完善基于腦脊液外泌體 miRNA 的腦膠質瘤液體活檢床旁技術。

四、問題與展望

液體活檢是早期篩查和診斷腦膠質瘤的有效手段，在病人個體化診療、療效評估及復發檢測等方面具有指導意義。外泌體作為一種可靠的標志物可以在腦脊液和血液中被檢測到，其包裹的各種分子可以更加全面地反映膠質瘤的整體情況，提高了腦膠質瘤診斷的準確性；雖然膠質瘤外泌體作為液體活檢的重要標志物具有很大的潛力，但目前仍面臨諸多的挑戰與困難。由腦脊液提取外泌體可以避免其他來源外泌體的干擾，但腰椎穿刺術仍是一種有創性檢查手段，不利于反復多次進行；從血液中純化外泌體對病人傷害小，風險低，操作簡便，是理想的液體活檢采樣途徑。因此，研發更加優化的外泌體分離提取及檢測技術，通過血液中的外泌體來診斷膠質瘤，是未來需要解決的重要課題。目前，雖然對膠質瘤外泌體研究很多，但仍缺少可以明確用于膠質瘤診斷的分子。

總之，在當今腫瘤精準醫療的時代背景之下，以腦膠質瘤外泌體為靶標的液體活檢可以有效彌補傳統檢查手段的缺點，使得操作更加簡便、結果更加準確、成本更加低廉，有助于對病人進行個體化精準診療。