右美托咪定通過調控LncRNA HOXA11-AS/miR-515-5p抑制膀胱癌細胞增殖并誘導細胞凋亡

劉建秀 袁曉斌

(1濟南市第三人民醫院麻醉科，山東 濟南 250101；2青島市中醫醫院(青島市海慈醫院)疾控科)

膀胱癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其具有極強的侵襲性及轉移能力〔1〕，目前關于膀胱癌發病機制尚未闡明。研究表明部分抗腫瘤藥物可用于治療膀胱癌，但患者易產生耐藥性而降低治療效果〔2〕。因而需深入探究膀胱癌發病機制并尋求安全高效的治療藥物從而提高膀胱癌治療效果。研究表明部分麻醉相關藥物對腫瘤細胞生長及轉移過程發揮重要調控作用〔3〕。右美托咪定(Dex)屬于選擇性α2-腎上腺受體激動劑，其具有良好的鎮靜、鎮痛等作用，研究表明Dex可抑制卵巢癌生長〔4,5〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在腫瘤發生過程中發揮重要作用，研究報道指出長鏈非編碼RNA HOXA11-AS(LncRNA HOXA11-AS)在非小細胞肺癌中呈高表達，可調控細胞增殖、侵襲、凋亡〔6,7〕。但HOXA11-AS在膀胱癌發生過程中的作用機制尚未闡明。starbase預測HOXA11-AS與微小RNA-515-5p(miR-515-5p)可能存在結合位點，研究表明miR-515-5p在前列腺癌中的具有抗癌作用〔8〕。本研究主要探討Dex對膀胱癌細胞增殖、凋亡及HOXA11-AS/miR-515-5p的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Dex購自湖北金梭生物；膀胱癌T24細胞購自上海晶抗生物；si-HOXA11-AS、si-NC、miR-515-5p mimics、miR-NC購自上海GenePharma；pcDNA3.1購自上海柯雷生物；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二抗購自北京百奧萊博；凋亡試劑盒購自上海美吉生物；Trizol、反轉錄及SYBR熒光染料試劑盒均購自日本TaKaRa；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen。

1.2方法

1.2.1Dex處理與實驗分組 膀胱癌T24細胞用不同濃度(25、50、100、200 ng/ml)的Dex處理T24細胞24 h，分別記作25 ng/ml Dex組、50 ng/ml Dex組、100 ng/ml Dex組、200 ng/ml Dex組〔9〕。未進行藥物處理的T24細胞作為NC組。觀察HOXA11-AS低表達與miR-515-5p高表達對T24細胞增殖和凋亡的影響，取對數期T24細胞，分別將si-NC、si-HOXA11-AS、miR-NC、miR-515-5p mimics轉染至T24細胞，分別記為si-NC組、si-HOXA11-AS組、miR-NC組、miR-515-5p組。轉染時嚴格按照Lipofectamine2000說明書進行操作。分別將pcDNA-NC、pcDNA-HOXA11-AS、pcDNA-HOXA11-AS與miR-NC、pcDNA-HOXA11-AS與miR-515-5p mimics轉染至T24細胞后加入含有100 ng/ml Dex的培養液培養24 h，分別記為Dex+pcDNA-NC組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-515-5p組。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中HOXA11-AS、miR-515-5p的表達水平 收集si-NC組、si-HOXA11-AS組、miR-NC組、miR-515-5p組、Dex+pcDNA-NC組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組、Dex+pcDNA-HOX A11-AS+miR-515-5p組細胞，采用Trizol法提取T24細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒進行RNA的反轉錄，制備cDNA。qRT-PCR反應體系及反應程序均按照SYBR熒光染料試劑盒說明書進行操作，應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測HOXA11-AS、miR-515-5p相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞存活率 收集NC組、25 ng/ml Dex組、50 ng/ml Dex組、100 ng/ml Dex組、200 ng/ml Dex組T24細胞接種至96孔板(5×103個/孔)，加入 MTT試劑(20 μl/孔)，繼續培養，4 h后將上清替換為150 μl DMSO，檢測490 nm處T24細胞的相對吸光度值(OD)。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組對數生長期T24細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，按照凋亡檢測試劑說明書操作并檢測細胞凋亡率。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測HOXA11-AS與miR-515-5p的靶向關系 starbase預測顯示HOXA11-AS與miR-515-5p存在互補配對結合位點。將野生型WT-HOXA11-AS載體、突變型MUT-HOXA11-AS載體分別與miR-NC、miR-515-5p mimics嚴格按照Lipofectamine2000說明書，共轉染T24細胞。繼續培養48 h后，檢測T24細胞熒光素酶活性。

1.2.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天科氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3蛋白表達 各組膀胱癌T24細胞加入RIPA裂解液獲得總蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜，封閉，4℃加入CyclinD1(1∶1 000)、C-caspase-3(1∶800)一抗稀釋液(美國CST)孵育12 h，室溫加入二抗(1∶3 000)孵育1 h，滴加ECL發光劑后，于避光環境曝光顯影，應用ImageJ軟件分析CyclinD1、C-caspase-3條帶灰度值。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1Dex對T24細胞增殖的影響 25、50、100、200 ng/ml Dex處理后，膀胱癌T24細胞存活率〔(88.27±8.82)%、(72.11±7.21)%、(54.28±5.43)%、(52.11±5.21)%〕相較于NC組〔(100.96±10.11%)〕明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.005)，100 ng/ml Dex組與200 ng/ml Dex組T24細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)，因而選用100 ng/ml Dex進行后續實驗研究。

2.2Dex對T24細胞凋亡的影響 相較于NC組，100 ng/ml Dex組膀胱癌T24細胞凋亡率和C-caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，見圖1、圖2、表1。

圖1 流式細胞儀檢測100 ng/ml Dex處理的T24細胞凋亡

圖2 Western印跡檢測100 ng/ml Dex處理的T24細胞中C-caspase-3蛋白表達

表1 100 ng/ml Dex對T24細胞凋亡及HOXA11-AS表達的影響

2.3Dex對HOXA11-AS和miR-515-5p表達的影響 與NC組比較，100 ng/ml Dex組膀胱癌T24細胞中HOXA11-AS表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-515-5p表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.4HOXA11-AS低表達對T24細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-HOXA11-AS組HOXA11-AS的表達水平、細胞存活率顯著降低(P<0.05)。si-HOXA11-AS組T24細胞凋亡率顯著高于si-NC組(P<0.05)。與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組T24細胞中CyclinD1蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖3、表2、圖4。

圖3 流式細胞儀檢測HOXA11-AS低表達后的T24細胞凋亡

圖4 Western印跡檢測CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.5miR-515-5p高表達對T24細胞增殖和凋亡的影響 miR-515-5p組T24細胞中miR-515-5p的表達水平顯著高于miR-NC組(P<0.05)。miR-515-5p組T24細胞存活率較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率較miR-NC組顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達量較miR-NC組顯著升高(P<0.05)，見圖5、圖6、表3。

圖5 流式細胞儀檢測miR-515-5p高表達后T24細胞凋亡

圖6 各組CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.6HOXA11-AS靶向調控miR-515-5p的表達 HOXA11-AS與miR-515-5p的靶向結合通過StarBase預測，見圖7。miR-515-5p mimics與野生型載體WT-HOXA11-AS共轉染T24細胞的熒光素酶活性相較于miR-NC與野生型載體WT-HOXA11-AS共轉染T24細胞顯著降低(P<0.05)；miR-515-5p mimics與突變型載體MUT-HOXA11-AS共轉染T24細胞的熒光素酶活性相比于miR-NC與突變型載體MUT-HOXA11-AS共轉染T24細胞差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。si-HOXA11-AS組膀胱癌T24細胞中miR-515-5p的表達水平(2.86±0.28)顯著高于si-NC組(1.02±0.12，P<0.05)；pcDNA-HOXA11-AS組膀胱癌T24細胞中miR-515-5p的表達水平(0.40±0.04)顯著低于pcDNA-NC組(1.00±0.11，P<0.05)。

圖7 StarBase對HOXA11-AS和miR-515-5p結合進行預測示意

表4 miR-NC或miR-515-5p與報告質粒共轉染T24細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.7HOXA11-AS高表達可以逆轉Dex對T24細胞增殖和凋亡的影響 與Dex+pcDNA-NC組比較，Dex+pcDNA-HOXA11-AS組T24細胞中HOXA11-AS的表達水平、細胞存活率及CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率及C-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖8、圖9、表5。

圖8 流式細胞儀檢測HOXA11-AS高表達和Dex作用的T24細胞凋亡

1，2：Dex-pcDNA-NC組,Dex+pcDNA-HOXA11-AS組圖9 Western印跡檢測各組CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.8高表達miR-515-5p可以逆轉HOXA11-AS高表達對Dex處理的T24細胞增殖和凋亡的影響 與Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組比較，Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-515-5p組細胞存活率及CyclinD1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率及C-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表6、圖10、圖11。

1，2：Dex-pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組,Dex-pcDNA-HOXA11-AS+miR-515-5p組；下圖同圖10 流式細胞儀檢測高表達miR-515-5p、HOXA11-AS高表達和Dex作用的T24細胞凋亡

圖11 Western印跡檢測CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

3 討 論

研究表明LncRNA在膀胱癌中異常表達并可參與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等過程，進一步研究顯示LncRNA可能通過調控下游miRNA表達從而發揮作用〔10,11〕。Dex可誘導卵巢癌細胞凋亡及抑制細胞增殖、遷移及侵襲能力〔12〕。研究表明Dex在乳腺癌發生發展過程發揮重要調控作用〔13〕。相關報道指出Dex可抑制宮頸癌細胞增殖及遷移〔14〕。本研究結果提示Dex可抑制膀胱癌細胞增殖、誘導凋亡。

HOXA11-AS在胃癌細胞中呈高表達，并可促進胃癌細胞增殖及侵襲〔15〕。研究表明HOXA11-AS通過充當miR-125a-5p的海綿分子促進骨肉瘤轉移〔16〕。本研究結果提示Dex可能通過下調HOXA11-AS的表達而發揮作用。本研究證實HOXA11-AS能夠靶向調控miR-515-5p的表達。miR-515-5p在乳腺癌、非小細胞肺癌中呈低表達并可促進細胞增殖〔17,18〕。