miR-132在慢性心力衰竭大鼠下丘腦室旁核表達

李晶 張馳 王鑫 劉羽承 郭錦華， 王東 賈琳琳

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1生理教研室，黑龍江 佳木斯 154000；2微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室；3佳木斯市婦幼保健院；4佳木斯市腫瘤醫(yī)院)

中樞機制在慢性心力衰竭(CHF)發(fā)病進程中具有重要效應(yīng)，廣大科研工作者主要把調(diào)控心血管活動的重要中樞并具調(diào)節(jié)體液平衡的核團即下丘腦室旁核(PVN)作為研究靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，存在于PVN中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素神經(jīng)元(CRH能神經(jīng)元)若過度激活可增加交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性〔1，2〕，可能是通過增加活性氧簇生成及腎素-血管緊張素(Ang)-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和炎性因子之間的表達喪失平衡而造成的。通常臨床上判定患者預(yù)后及治療的靶點之一是交感神經(jīng)過度激活，這也是CHF的重要病理特征。生物內(nèi)源性的非編碼小RNA(microRNA)中發(fā)現(xiàn)較早的就是首次在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的miR-132，其與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系尤為密切〔3，4〕，并且調(diào)節(jié)CNS的功能和發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-132 可借助多種信號途徑上調(diào)谷氨酸受體(興奮性神經(jīng)遞質(zhì))的表達〔4，5〕。還可由AngⅡ誘導(dǎo)miR-132表達上調(diào)來促進心肌纖維化和心肌肥厚的發(fā)生。本研究觀察miR-132在CHF下丘腦PVN的表達并探討其可能影響下丘腦PVN交感輸出的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康、雄性、清潔級SD大鼠36只以隨機數(shù)字原則分為CHF組、假手術(shù)(Sham)組、正常對照(Ctrl)組各12只。體重225～255 g，實驗動物購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(黑)2019-001。

1.2模型制造 給予大鼠水合氯醛(濃度10%，劑量40 mg/kg)腹腔部位注射，CHF組左冠狀動脈前降支結(jié)扎的具體術(shù)式操作如下：當(dāng)大鼠處于深麻醉狀態(tài)時，進行仰臥位固定在自制的手術(shù)臺上(厚泡沫盒蓋子)，借助小兒喉鏡行經(jīng)口的氣管插管術(shù)，并連接小動物呼吸機。待呼吸平穩(wěn)后(呼吸機參數(shù)設(shè)置成和大鼠呼吸頻率一樣)于左側(cè)第4、5肋間隙持手術(shù)剪進入胸腔(預(yù)先碘伏消毒、嬰兒理發(fā)器剃掉胸部鼠毛)，鈍性分離后充分暴露心臟(借助眼科開瞼器向兩側(cè)推拉肋骨)，切勿觸碰心臟，確定好左冠狀動脈所在位置后，用5-0眼科手術(shù)線穿過左冠狀動脈前降支偏上的位置，并打結(jié)2次；打完結(jié)后肉眼可見心尖顏色馬上變淺。Ctrl組不給予任何處理；Sham組左冠狀動脈前降支僅把手術(shù)線在其下方穿過，并不打結(jié)。3組均在4 w后進行心功能檢測，以左室舒張末壓力(LVEDP)≥15 mmHg判定CHF模型建立成功〔6〕。

1.3儀器和試劑 主要儀器：高效液相色譜(HPLC)儀(賽智科技有限公司)、BL-420生物機能信號系統(tǒng)(成都泰盟公司)、石蠟切片機(Leica RM2235)、東芝四維彩超(型號Aplio50)、倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus)、全自動多功能酶標(biāo)儀(Bio Tek)、VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能科技有限公司)、全自動凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、立體顯微鏡(SZ6060)等。主要試劑、試劑盒和相關(guān)抗體等購于碧云天生物技術(shù)有限公司和武漢博士德生物有限公司，引物由上海Invitrogen公司設(shè)計并提供。

1.4心功能檢測 應(yīng)用嬰兒心臟彩超和BL-420生物信號系統(tǒng)檢測血流動力學(xué)來反映心功能，連續(xù)測5個心動周期并記錄心率(HR)、LVEDP、左室收縮壓(LVSP)、射血分?jǐn)?shù)(EF)的數(shù)據(jù)變化。按參考文獻〔6〕步驟進行、臨床專業(yè)超聲醫(yī)師操作。斷頭處死動物，開胸取心臟和肺稱重后，再分離右心室及室間隔稱重，分別計算肺、體質(zhì)量比(L/BW)和右心室、體質(zhì)量比(RVW/BW)。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟進行操作。從內(nèi)側(cè)靜脈取靜脈血(長度約2 cm、內(nèi)徑1.0 mm的毛細吸管，經(jīng)肝素預(yù)處理后備用)。交感神經(jīng)興奮性高低用血漿中遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)水平表示，同時檢測血漿中利鈉肽 (BNP)濃度。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 試驗結(jié)束在麻醉狀態(tài)下斷頭快速取下腦組織，按照大鼠腦定位圖譜確定PVN區(qū)域(視交叉后緣向后1.5～2.0 mm，垂直7.1～8.1 mm)。并測定PVN中miR-132表達量。具體操作按下述步驟進行：提取組織中的總RNA，以從樣本中提取1 μg作為逆轉(zhuǎn)錄模板來制作cDNA，后把cDNA作為模板建立RT-PCR體系。miR-132表達量及反應(yīng)條件參考楊波等〔7〕方法。

1.7HPLC檢測 HPLC法檢測下丘腦PVN谷氨酸含量。把腦組織(下丘腦PVN組織經(jīng)超聲粉碎)勻漿后取上清液備用，并由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院專業(yè)技術(shù)人員完成。

1.8組織學(xué)觀察 持續(xù)4 w的試驗結(jié)束后，麻醉狀態(tài)下斷頭并處死大鼠。同時，剪開胸腔并把心臟充分暴露出來，在冰盤上快速剪下心臟，然后用生理鹽水沖洗干凈，并用濾紙把鹽水吸干凈。取心尖部心肌組織固定于4%多聚甲醛溶液中。常規(guī)方法處理蘇木素-伊紅(HE)染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1心功能檢測結(jié)果 Ctrl組與Sham組各項心功能指標(biāo)沒有顯著差異(P>0.05)；CHF組中除HR外，其余各項心功能指標(biāo)均與Ctrl組和Sham組差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2RT-PCR檢測結(jié)果 CHF組miR-132在下丘腦PVN中表達(32.37±4.52)較另外兩組明顯增加(P<0.05)；miR-132在Ctrl組與Sham組下丘腦PVN的表達(7.72±0.23 vs 8.59±0.31)無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 miR-132在3組下丘腦PVN的相對表達

2.3ELISA和HPLC檢測結(jié)果 CHF組血漿NE、BNP水平及下丘腦PVN谷氨酸含量與Ctrl組與Sham組相比明顯增加(P<0.05)；Ctrl組與Sham組血漿NE、BNP和下丘腦PVN谷氨酸含量無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 3組血漿NE、BNP及下丘腦PVN谷氨酸含量

2.4組織學(xué)檢測結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察到CHF組心肌組織出現(xiàn)由缺血缺氧導(dǎo)致的肌纖維紊亂、皺縮和肌間隙增寬，部分心肌細胞出現(xiàn)脂肪和空泡變性；Ctrl組與Sham組心肌組織未見異常。見圖2。

圖2 3組心肌組織學(xué)檢測結(jié)果(HE染色，×400)

3 討 論

心血管反射調(diào)節(jié)紊亂和CNS整合機制紊亂可導(dǎo)致交感神經(jīng)過度激活，應(yīng)用受體阻斷劑不能降低心衰狀態(tài)下循環(huán)血液中的NE濃度，而阻斷中樞內(nèi)某些體液因素的作用能改善交感神經(jīng)興奮性和心功能，提示CNS整合機制可能在CHF進程中起著更重要的作用。下丘腦PVN中核團的相關(guān)神經(jīng)體液調(diào)節(jié)因子的異常表達可致交感神經(jīng)活動增強，是由于該核團可直接調(diào)控脊髓交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元的活動狀態(tài)。而下丘腦PVN中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)就是谷氨酸，可借助氨基酸遞質(zhì)調(diào)控交感輸出，并參與心血管反射活動。向CHF大鼠PVN內(nèi)微量注射谷氨酸受體拮抗劑，對腎交感神經(jīng)的興奮性及HR和血壓都有顯著的降低效應(yīng)〔8，9〕。本實驗結(jié)果也證實了這一點。miR-132是一類進化保守的miRNA，由于在與神經(jīng)相關(guān)的組織中廣泛、高度表達并與CNS功能密切相關(guān)而被稱為“NeurimmiR”〔10〕。在CNS與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦區(qū)海馬等部位，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可促進miR-132表達，可能是通過有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2通路發(fā)揮效應(yīng)，同時誘導(dǎo)突觸中可塑性相關(guān)蛋白的合成量及增加興奮性遞質(zhì)谷氨酸受體的表達來發(fā)揮作用〔11〕。Krol等〔12〕研究結(jié)果證實神經(jīng)細胞的實時狀態(tài)也可調(diào)控miRNA的表達和新陳代謝，而大多數(shù)神經(jīng)細胞中miRNA的轉(zhuǎn)變加速或縮減都和谷氨酸受體被興奮或被抑制相關(guān)。由此本文推測心力衰竭時下丘腦PVN miR-132可能通過影響谷氨酸或受體的表達來影響交感輸出；同時興奮性增高的谷氨酸能神經(jīng)元也可反饋調(diào)控miR-132的表達。而作用于谷氨酸的離子通道型受體門冬氨酸(NMDA)來發(fā)揮作用的主要有RAAS中的Ang轉(zhuǎn)換酶1型受體(AT1R)及Ang轉(zhuǎn)換酶。從而提高谷氨酸能神經(jīng)元興奮性、突觸傳遞效能和PVN交感輸出〔13〕。在外周心肌組織，AngⅡ可誘導(dǎo)miR-132表達上調(diào)參與心肌肥厚和纖維化進程。本研究結(jié)果說明CHF后心臟功能明顯降低。本研究中尚未闡述miR-132與谷氨酸之間的相互作用機制及此兩種因子對交感神經(jīng)興奮性影響的效應(yīng)。此外，動物實驗證實miR-132抑制劑可用于治療CHF并具有良好的藥代動力學(xué)、安全性和耐受性；臨床實驗證實在具有典型癥狀的CHF患者循環(huán)血液中，miR-132水平隨心力衰竭的嚴(yán)重程度而升高，特別是低濃度的miR-132可作為評價患者再入院治療的風(fēng)險因素〔14，15〕。