宮頸癌細胞分泌外泌體對宮頸癌細胞增殖、凋亡功能及MAPK/ERK信號通路的影響

劉晶 王景 葛靜 王旭 馮艷萍 房桂英 李林

(河北醫科大學第一醫院婦產科，河北 石家莊 050031)

外泌體富含DNA、RNA、蛋白質等多種成分，在免疫反應、細胞通訊、血管生成、腫瘤發生等過程中發揮重要作用；血液、唾液、腹腔積液、胸水、尿液等體液中均可分離出外泌體，故外泌體在人體內分布比較廣泛〔1〕。外泌體在惡性腫瘤發生發展中的作用越來越受到重視，各種來源的外泌體可產生特異性惡性腫瘤相關的mRNA、蛋白質等活性物質，并可將這些活性物質傳遞給免疫細胞、內皮細胞、間質細胞、炎癥細胞等，通過改變受體細胞蛋白功能達到促進惡性腫瘤增殖、凋亡、侵襲遷移等目的〔2,3〕。外泌體在宮頸癌中的作用也受到大家關注，易紅艷等〔4〕采用差速超離心法分離宮頸癌細胞Siha細胞外泌體，并發現其可介導宮頸癌前細胞Ect1發生上皮間質轉化，從而提高Ect1細胞的體外侵襲能力。但宮頸癌細胞來源的外泌體在宮頸癌增殖凋亡中的作用及其可能作用機制尚不十分清楚。絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調節激酶(MAPK/ERK)信號通路為細胞內重要的促進細胞增殖、抑制細胞凋亡信號通路之一〔5〕，可通過影響其下游的細胞增殖及凋亡相關蛋白的活性，在宮頸癌細胞增殖、凋亡中發揮重要作用〔6〕。本研究旨在探討宮頸癌C33A細胞外泌體對其自身增殖凋亡影響的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞系、主要試劑及儀器 人宮頸癌C33A細胞系(ATCC細胞庫)，FKH-67染劑、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、DAPI、Alex Fluro 594 Phalloidin(美國Sigma公司)；RPMI1640培養基、KGM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；兔抗人CD81抗體、兔抗人CD63抗體、兔抗人ERK1/2多克隆抗體、兔抗人磷酸化(p)ERK1/2多克隆抗體(美國Abcam公司)；JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子公司)；共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1人宮頸癌C33A細胞培養 C33A細胞復蘇后，用RPMI1640(含青霉素和鏈霉素)的培養基常規培養，C33A細胞生長穩定后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，更換無血清KGM培養基培養，每3 d換液1次，收集上清液用于提取外泌體。

1.2.2C33A細胞外泌體的提取和鑒定 將上述收集的C33A細胞上清液離心(300 r/min)5 min，去掉死亡細胞，再離心(2 000 r/min)20 min，再離心(10 000 r/min)30 min，將離心得到的上清液進行濃縮，在濃縮上清液中加入總外泌體分離試劑過夜孵育，離心(10 000 r/min)60 min，用PBS重懸沉淀，用磷鎢酸負染。透射電鏡下拍照并觀察分泌的外泌體形態；并用Western印跡測定分泌外泌體CD63和CD81蛋白表達情況。

1.2.3C33A細胞對外泌體的攝取實驗 將C33A細胞接種到共聚焦培養皿中(接種密度為1×104個/ml)常規培養，待細胞貼壁生長后加入PKH67(2 μg)標記外泌體，培養48 h后用PBS液清洗，多聚甲醛(4%)固定10 min，Triton透化10 min增加通透性，加入牛血清白蛋白(BSA)孵育30 min降低染色背景，加入Alex Fluro 594 Phalloidin染色細胞骨架中的F-actin，加入DAPI染色細胞核，共聚焦顯微鏡下拍照并觀察C33A細胞對外泌體的攝取情況。

1.2.4C33A細胞分組 將C33A細胞分為外泌體(Exo)組和對照(C)組，Exo組C33A細胞中加入含10 μl外泌體的RPMI1640培養基，C組C33A細胞中加入含等量PBS的培養基〔7〕，收集培養24 h細胞用于后續研究。

1.2.5MTT測定C33A細胞增殖能力 將Exo組和C組C33A細胞接種到96孔板中培養，每組設7個復孔，分別于培養1 d、3 d、5 d加入5 g/L MTT染色，繼續培養4 h，吸出上清液，加入DMSO 150 μl震蕩均勻，酶標儀測定波長570 nm處吸光度(A)值。

1.2.6克隆形成實驗測定C33A細胞集落形成能力 將Exo組和C組C33A細胞平鋪于6孔板中，每孔300個細胞，每組設7個復孔，培養2 w，棄去培養基，甲醇固定30 min，結晶紫(0.4%)染色15 min，拍照并統計每孔集落形成數量。

1.2.7流式細胞術測定C33A細胞凋亡能力 將Exo組和C組C33A細胞接種到6孔板中，每孔2×105個細胞，每組設7個復孔，分別加入Annexin-V 5 μl和PI 5 μl混勻，反應15 min，加入緩沖液400 μl，流式細胞儀檢測C33A細胞凋亡情況。其中左下象限為活細胞；右上象限為壞死細胞；右下象限為凋亡細胞。

1.2.8Western印跡測定C33A細胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平 將Exo組和C組C33A細胞中加入RIPA裂解液，提取總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法進行定量測定，每組取40 μg總蛋白進行電泳，并轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)過夜孵育，以β-actin為內參，加入二抗(1∶15 000)孵育1 h，電化學發光(ECL)顯色，暗室曝光顯影，Image J軟件分析蛋白水平，ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平=ERK1/2、p-ERK1/2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1C33A細胞來源外泌體鑒定 超速離心法富集C33A細胞外泌體，透射電鏡下見外泌體直徑40～140 nm，呈類圓形囊泡結構；Western印跡檢測見C33A細胞來源囊泡狀小體中富含CD63和CD81蛋白，表明C33A細胞中分離的囊泡狀小體為外泌體，見圖1和圖2。

圖1 電鏡下觀察C33A細胞來源囊泡狀小體形態

圖2 Western印跡測定外泌體中CD63、CD81蛋白水平

2.2C33A細胞攝取外泌體情況 激光掃描共聚焦顯微鏡下發現：外泌體作用C33A細胞72 h后，細胞骨架中的F-actin被Alex Fluro 594 Phalloidin染色為紅色；細胞核被DAPI染色為藍色；被PKH67標記的外泌體呈綠色熒光，主要位于細胞質中，主要在細胞核周圍分布，且幾乎所有C33A細胞均可見綠色熒光，表明C33A細胞來源的外泌體可被C33A細胞攝取。見圖3。

圖3 免疫熒光測定C33A細胞攝取外泌體情況(×400)

2.3外泌體對C33A細胞增殖能力的影響 1 d、3 d、5 d，Exo組C33A細胞A值明顯高于C組(P<0.05)，見表1。

表1 各組C33A細胞A值比較

2.4外泌體對C33A細胞集落形成數的影響 Exo組C33A細胞集落形成數明顯高于C組(P<0.001)，見圖4、表2。

圖4 克隆形成實驗測定C33A細胞集落形成能力

表2 各組C33A細胞集落形成數和細胞凋亡率比較

2.5外泌體對C33A細胞凋亡能力的影響 Exo組C33A細胞凋亡率明顯低于C組(P<0.001)，見表2、圖5。

圖5 流式細胞術測定C33A細胞凋亡能力

2.6外泌體對C33A細胞MAPK/ERK信號通路的影響 兩組C33A細胞ERK1/2蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)；Exo組C33A細胞p-ERK1/2蛋白水平明顯高于C組(P<0.001)，見表3、圖6。

表3 各組C33A細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比較

圖6 Western印跡測定各組C33A細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平

3 討 論

外泌體合成的第一步為細胞質膜向內凹陷形成內體，內體的膜結構向內凹陷，胞質RNA和蛋白被選擇性裝進內部囊泡，形成多泡體，多泡體和細胞膜相融合，釋放外泌體〔8〕。外泌體可能通過內吞、直接融合、通過外泌體表明蛋白結合三種方式作用于靶細胞〔9〕。外泌體雖可被多數細胞分泌，但在癌癥等病理條件下外泌體的釋放增加，其在惡性腫瘤微環境中的含量尤其豐富，外泌體可介導細胞之間交流，腫瘤細胞來源的外泌體常攜帶有惡性腫瘤抗原，并且外泌體內的RNA和蛋白質等具有生物學功能，這些RNA和蛋白質傳遞到效應細胞中，在惡性腫瘤的增殖、凋亡及侵襲遷移中發揮重要作用〔10,11〕。研究發現外泌體在惡性腫瘤細胞增殖和凋亡中發揮重要作用，如乳腺癌細胞的外泌體在可促進CD133+癌細胞增殖并抑制細胞凋亡〔12〕；癌細胞來源外泌體可促進非小細胞肺癌細胞增殖并抑制細胞凋亡〔13〕；巨噬細胞來源的外泌體抑制乳腺癌細胞凋亡，促進乳腺癌細胞增殖〔14〕。本研究結果表明宮頸癌細胞來源外泌體在其自身增殖和凋亡中發揮重要作用。

MAPK/ERK信號通路為促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的主要通路之一〔15〕，磷酸化激活的ERK(p-ERK)可通過促進細胞周期蛋白D1表達，使細胞周期蛋白D1水平升高，是細胞周期從G1期向S期轉換，促進細胞分裂增殖，從而增加宮頸癌細胞的增殖能力〔16,17〕。p-ERK對細胞凋亡終末效應器半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的活性具有直接抑制作用，對各種刺激誘導的細胞凋亡具有阻斷作用〔18〕；p-ERK還可通過活化細胞凋亡蛋白抑制劑IAPs等抑制凋亡分子間接抑制caspase-3活性，進而抑制宮頸癌細胞凋亡，從而促進宮頸癌的發展〔19〕。外泌體可通過多種信號通路參與惡性腫瘤的增殖凋亡過程〔20〕，如Chen等〔21〕研究發現肝細胞癌細胞來源的外泌體可通過MAPK/ERK信號傳導途徑促進肝細胞癌細胞上皮-間質轉化，引發肝細胞癌的進展和復發。Qu等〔22〕研究發現肝細胞癌細胞來源的外泌體在體外和體內可通過MAPK/ERK通路促進肝細胞癌細胞增殖。上述研究提示MAPK/ERK在宮頸癌的增殖凋亡中發揮重要作用，外泌體可通過MAPK/ERK信號通路參與惡性腫瘤的增殖凋亡過程，由此推測MAPK/ERK信號通路可能參與外泌體影響宮頸癌增殖凋亡的過程。本研究結果表明宮頸癌C33A細胞來源外泌體可激活宮頸癌C33A細胞中MAPK/ERK信號通路，宮頸癌C33A細胞來源外泌體可能通過MAPK/ERK信號通路促進其自身增殖、抑制其凋亡。