遠志皂苷調控miR-325-5p/GADD45B對高糖誘導小鼠足細胞損傷的影響及其機制

高虹 焦宏偉 貝寧 葉苗苗

(海南省干部療養院 海南省老年病醫院內科，海南 海口 571100)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發癥之一，足細胞在DN的發病機制中起關鍵作用，高糖導致足細胞肥大、脫落和凋亡，足細胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達下調，產生蛋白尿〔1〕。研究發現遠志皂苷(TEN)對Aβ140引起的神經細胞毒性〔2〕、大鼠心肌缺血再灌注損傷〔3〕及過氧化氫誘導的PC12細胞損傷〔4〕有明顯的保護作用。但具體機制尚不清楚。miR-325-3p在糖尿病大鼠視網膜中miR-325-3p表達下調，叔丁基對苯二酚通過上調miR-325-5p表達對2型糖尿病大鼠視網膜起保護作用〔5〕。本研究通過StarBase預測發現，GADD45B可能是miR-325-5p的靶基因。GADD45B是DNA損傷修復的重要相關基因家族成員之一，轉化生長因子(TGF)-β刺激引起的足細胞損傷中上調表達〔6〕。本研究假設遠志皂苷通過調控miR-325-3p/GADD45B通路影響高糖誘導的小鼠足細胞損傷，以小鼠腎臟足細胞系MPC5高糖誘導產生的細胞損傷為模型，并對此假設進行驗證。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠永生性腎臟足細胞系MPC5購自ATCC；RPMI1640培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；TEN(純度98.5%)購自成都普思生物科技股份有限公司；干擾素(IFN)-γ、鼠尾膠原蛋白Ⅰ、胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；抗GADD45B抗體、抗podocin抗體、抗nephrin抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自英國Abcam公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、總RNA提取試劑Trizol、 實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、RT-PCR反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；miR-325-3p模擬物(miR-325-3p)/miR-325-3p抑制劑(anti-miR-325-3p)、陰性對照(miR-NC和anti-miR-NC)、GADD45B的野生型(WT-GADD45B)和突變型(MUT-GADD45B)雙熒光報告載體購自上海吉瑪基因；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；流式細胞儀購自美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、分化和分組〔7〕細胞培養和分化：將MPC5在含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素及10 U/ml IFN-γ的RPMI1640培養基中培養，置33℃ 5%CO2、濕度95%的培養箱中培養，待細胞基本融合為一層時，收集細胞，將傳代的MPC5細胞轉入瓶底鋪有0.1 mg/ml的鼠尾膠原蛋白Ⅰ分化培養液中，37℃ 5%CO2、濕度95%的條件下培養12～14 d，細胞分化成熟。

實驗分組：對照(NG)組：RPMI1640培養基+D-葡萄糖5 mmol/L；高糖刺激(HG)組：RPMI1640培養基+D-葡萄糖30 mmol/L；高糖刺激+TEN(HG+TEN)組：RPMI1640培養基+D-葡萄糖30 mmol/L+TEN 50、100 或200 μmol/L即為HG+TEN-L組、HG+TEN-M組、HG+TEN-H組；高糖刺激+轉染(HG+轉染)組：轉染48 h后用RPMI1640培養基+D-葡萄糖30 mmol/L進行處理24 h；高糖刺激+TEN+轉染(HG+TEN+轉染)組：轉染48 h后用RPMI1640培養基+D-葡萄糖30 mmol/L+TEN 200 μmol/L進行處理24 h。

1.2.2細胞轉染 將MPC5以每孔4×105個細胞/孔接種于6孔板中，培養至細胞融合度為80%～90%時進行轉染。轉染分組：miR-325-3p過表達組(轉染miR-325-3p，以miR-NC為對照)，miR-325-3p抑制組(轉染anti-miR-325-3p，以anti-miR-NC為對照)，雙熒光素酶報告系統組(轉染miR-325-3p+WT-GADD45B、miR-NC+WT-GADD45B、miR-325-3p+MUT-GADD45B或miR-325-3p+WT-GADD45-B)。將無血清培養液稀釋的等體積脂質體和各組載體混合，室溫孵育20 min，加入培養好的細胞中，培養6 h，棄無血清培養液，加入RPMI1640完全培養基，轉染48 h，收集細胞。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-325-3p和GADD45B mRNA的表達 收集各組MPC5細胞，按照總RNA提取試劑盒的說明書提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，取cDNA為模板按照qRT-PCR的說明書進行反應合成miR-325-3p和GADD45B mRNA，反應程序為：95℃ 5 min；94℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 45 s，42個循環；72℃ 10 min。用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達 收集各組MPC5細胞，加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解細胞，然后進行超聲破碎，收集細胞中的蛋白，測定總蛋白濃度。將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉2 h，加入稀釋的各個一抗(GADD45B抗體1∶1 000、podocin抗體1∶1 000、nephrin抗體1∶1 000、Bcl-2抗體1∶2 000、Bax抗體1∶3 000和GAPDH抗體1∶4 000)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入稀釋的酶標記二抗，室溫孵育2 h，以GAPDH 為內參。

1.2.5流式細胞術測定細胞凋亡率 收集經葡萄糖或(和)TEN處理或轉染后各組MPC5細胞，胰酶消化，離心收集細胞，按照膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒說明書進行操作，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，混勻，室溫避光15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 根據1.2.2進行MPC5細胞培養和轉染，將構建的PRMT5的野生型(WT-PRMT5)和突變型(MUT-PRMT5)雙熒光素酶報告載體分別與miR-NC或miR-188-5p共轉染MPC5細胞，轉染后培養48 h，收集細胞并進行裂解，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1TEN對高糖誘導的小鼠足細胞中podocin和nephrin蛋白表達的影響 與NG組相比，HG組podocin和nephrin 蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+TEN-L組、HG+TEN-M組和HG+TEN-H組的podocin和nephrin蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)，呈濃度依賴趨勢均(P<0.05)，見圖1、表1。說明TEN可以促進高糖誘導的小鼠足細胞中podocin和nephrin的表達，抑制高糖誘導的小鼠足細胞損傷。

1～5：NG組，HG組，HG+TEN-L組，HG+TEN-M組，HG+TEN-H組，下圖同圖1 Western印跡檢測podocin和nephrin蛋白表達

2.2TEN對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組MPC5細胞凋亡率和Bax水平顯著上升(P<0.05)，Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+TEN-L組、HG+TEN-M組和HG+TEN-H組足細胞凋亡率和Bax水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)，呈濃度依賴性(均P<0.05)。見表1、圖2、圖3。說明高糖促進小鼠足細胞凋亡，TEN抑制了高糖誘導的小鼠足細胞凋亡。

圖2 TEN對高糖誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達

2.3TEN對高糖誘導的小鼠足細胞中miR-325-3p和GADD45B表達的影響 與NG組相比，HG組MPC5細胞中miR-325-3p表達顯著下調(P<0.05)，GADD45B mRNA和蛋白表達顯著上調(P<0.05)；與HG組相比，HG+TEN-L組、HG+TEN-M組和HG+TEN-H組足細胞中miR-325-3p表達顯著上調(P<0.05)，GADD45B mRNA和蛋白表達顯著下調(P<0.05)，呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖4。說明高糖可下調小鼠足細胞miR-325-3p水平并上調GADD45B水平，TEN逆轉了這一作用。

圖4 Western印跡檢測GADD45B蛋白表達

2.4miR-325-3p靶向調控GADD45B的表達 通過StarBas預測顯示，GADD45B的3′UTR序列中含有與miR-325-3p互補的核苷酸序列，見圖5。與miR-NC組相比，miR-325-3p組GADD45B野生型WT-GADD45B熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-GADD45B熒光素酶相對活性無明顯變化(P>0.05)。見表2。miR-325-3p組GADD45B蛋白(0.22±0.03)顯著低于miR-NC組(0.41±0.04，P<0.05)；anti-miR-325-3p組GAPD-45B蛋白(0.83±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.38±0.03，P<0.05)。見圖6。說明miR-325-3p靶向負調控GADD45B的表達。

圖5 GADD45B的3′UTR中含有與miR-325-3p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組，miR-325-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-325-3p組圖6 Western印跡檢測各組GADD45B水平

2.5miR-325-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-325-3p組MPC5細胞中miR-325-3p、podocin、nephrin和Bcl-2水平顯著上升(P<0.05)，GADD45B、Bax蛋白表達水平及細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表3、圖7、圖8。說明過表達miR-325-3p可抑制高糖誘導的小鼠足細胞MPC5損傷，并抑制細胞凋亡。

1～2：HG+miR-NC組，HG+miR-325-3p組圖7 Western印跡檢測GADD45B、podocin、nephrin及凋亡蛋白水平

圖8 miR-325-3p過表達對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的影響

2.6抑制miR-325-3p表達逆轉了TEN(200 μmol/L)對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的作用 與HG+TEN+anti-miR-NC組相比，HG+TEN+anti-miR--325-3p組miR-325-3p、podocin、nephrin和Bcl-2含量顯著下降(P<0.05)，GADD45B、Bax蛋白表達量及細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖9、表4。

1，2：HG+TEN+anti-miR-NC組，HG+TEN+anti-miR-325-3p組圖9 抑制miR-325-3p表達逆轉了TEN對高糖誘導的小鼠足細胞損傷的作用

3 討 論

TEN是中藥遠志的活性成分之一，具有祛痰鎮咳、益智、保護心腦血管、抗老年癡呆等功能〔8〕。目前針對TEN的主要研究集中在抗老年癡呆、益智等方面。研究表明，在2型糖尿病和阿爾茨海默病(AD)小鼠模型中，TEN可改善小鼠記憶障礙，調控2型糖尿病小鼠的血糖和血脂，具有益智和降糖作用〔9〕。本研究結果說明TEN對足細胞具有潛在的臨床保護作用。

生長阻滯和GADD45B是GADD45基因家族中的一員，參與細胞周期阻滯、細胞存活或凋亡及DNA損傷修復等過程〔10〕。研究表明GADD45B在斑馬魚足細胞損傷模型中表達上調，可能通過激活ROS-GADD45B-p38通路加重水腫、蛋白尿和足突消退，敲除GADD45B可改善足細胞損傷〔11〕。雷公藤內酯醇通過抑制p53-NF-κB/GADD45B信號傳導而減輕蛋白尿和足細胞凋亡，GADD45B在斑馬魚足細胞中的特異性過表達消除了雷公藤內酯醇對足細胞的保護作用〔12,13〕。

miR-325-3p在非小細胞肺癌和乙型肝炎型肝細胞癌中表達異常，與癌癥的進展和化療耐藥性有關〔14,15〕。本研究結果說明TEN確實通過調控miR-325-3p發揮對足細胞的保護作用。