lncRNA MVIH在結直腸癌細胞中表達及干擾其表達對SW620細胞功能的影響

張森 王建鋒 厲冰

(南陽市中心醫院胃腸外科，河南 南陽 473009)

結直腸癌是全球常見的第三大惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第四大原因；近年來其發病率在我國有明顯升高的趨勢，嚴重威脅著人們的身體健康和生活質量〔1，2〕。目前，復發、轉移和耐藥等是制約結直腸癌治療效果的重要原因〔3〕。因此，深入研究結直腸癌發生發展的分子機制，尋找確定有效抑制結直腸癌惡性增殖和轉移的治療靶點是十分必要的。長鏈非編碼RNA是一類不具有編碼蛋白質功能的長鏈RNA，被證實其異常表達可通過不同方式影響細胞增殖、轉移和分化等，與結直腸癌發生發展密切相關〔4～6〕。研究〔7～9〕顯示，肝癌微血管浸潤相關的lncRNA(lncRNA MVIH)在胃癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤中異常高表達，與患者預后不良密切相關，且可通過影響增殖、轉移和侵襲等細胞生物學功能發揮致癌作用。有學者〔10〕指出，lncRNA MVIH在結直腸癌組織中表達上調，且其高表達水平與患者轉移、生存期短有關；然而lncRNA MVIH在結直腸癌細胞中表達及作用未見報道。故本研究設計體外細胞實驗觀察lncRNA MVIH在結直腸癌細胞中的表達及干擾其表達對癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人正常結直腸上皮細胞株FHC(廣州吉妮歐生物科技公司)；人結直腸癌細胞株SW480、HT29、LOVO和SW620(中科院上海細胞庫)；RPMI1640培養基和0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；胎牛血清和青鏈霉素混合液(美國Gibco公司)；增強化學發光液(ECL)、CCK-8試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司)；實時定量-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司);轉染試劑脂質體2000和Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)；兔抗人E-鈣黏附蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-cadherin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶標記二抗(北京中杉金橋公司)。

1.2細胞培養 向解凍復蘇后的FHC、SW480、HT29、LOVO和SW620細胞中加入含10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素混合液的RPMI1640培養基，置于飽和濕度、5%CO2的37℃恒溫細胞培養箱中常規培養。待細胞貼壁80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并以1∶2比例傳代。選取長勢良好的第3代對數生長期細胞進行實驗。

1.3實時熒光定量PCR檢測 采用Trizol法提取FHC、SW480、HT29、LOVO和SW620細胞的總RNA后，參照RNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，以逆轉錄產物為模板，GAPDH為內參，根據實時定量PCR試劑盒說明書步驟，采用2-△△Ct法檢測細胞中lncRNA MVIH的表達水平。其中，由上海生工生物合成的PCR引物如下：LncRNA MVIH上游引物序列為5′-AATTTTGCACATCTGAACAGCC-3′，下游引物序列為5′-TTCAAAATCCCA-CTACGCCCA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物序列為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。實驗重復3次。

1.4細胞分組和轉染 實驗分為:①對照組：正常培養；②陰性組：轉染lncRNA MVIH干擾序列的陰性對照si-NC；③干擾組：轉染lncRNA MVIH干擾序列si-MVIH，每組設置3個重復。將對數生長期的SW620以每孔3×104個接種至6孔細胞板上后，在飽和濕度、5%CO2、37℃條件下常規培養過夜。待細胞達75%匯合度時，參照轉染試劑脂質體2000說明書，根據實驗分組將si-NC和si-MVIH分別轉染至SW620細胞中。轉染5 h后更換新鮮培養液繼續培養。待培養48 h后，胰蛋白酶消化收集各組細胞，并采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中lncRNA MVIH的表達水平以評價轉染效果。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染48 h后的3組細胞以每孔100 μl(含103個細胞)接種至96孔細胞板上，另將不含細胞的培養基作為調零孔。在細胞培養箱中常規培養，分別在培養24、48、72和96 h時取樣，參照CCK-8試劑盒說明書檢測各組細胞在450 nm處的光密度(OD)值。重復檢測3次。

1.6平板克隆實驗 將對數生長期的3組細胞以每孔100 μl(含103個細胞)接種至6孔細胞板上，置于細胞培養箱內常規培養12～15 d，當肉眼可見克隆時終止培養。以甲醛固定細胞20 min后，使用0.1%結晶紫染色15 min。洗去染液后，自然晾干。將超過50個細胞的集落作為1個有效克隆數，在倒置顯微鏡下拍照并統計各組克隆細胞數。實驗重復3次。

1.7Transwell小室檢測 采用無血清培養基將對數生長期的3組細胞制成濃度為3×105個/ml單細胞懸液。取細胞懸液200 μl接種于人工基底膜包被(侵襲實驗)或者未包被(遷移實驗)的Transwell小室上室中，并在下室中加入600 μl含血清的培養基。置于細胞培養箱內常規培養過夜后，將小室取出，使用棉簽小心擦去上室內殘留的細胞，以4%多聚甲醛固定和0.1%結晶紫染色。洗去染液后，自然干燥，在倒置顯微鏡下每個樣品隨機選取3個視野觀察各組的穿膜細胞數。

1.8Western印跡 測參照全蛋白提取試劑盒說明書步驟，提取轉染48 h后的3組細胞的總蛋白，并采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書定量總蛋白的濃度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后，在沸水浴中煮沸變性5 min。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書制備SDS-PAGE凝膠，按照每孔60 μg樣品上樣行電泳分離。電泳結束后，轉至聚偏氟乙烯膜。經5%脫脂奶粉封膜2 h后，浸入E-cadherin(1∶800)、Vimentin(1∶800)、N-cadherin(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗工作液4℃下孵育24 h。次日，再以辣根過氧化物酶標記二抗(1∶200)室溫孵育1.5 h后，滴加ECL顯色劑暗室內顯影曝光。以GAPDH為內參，采用凝膠成像系統掃描分析各組細胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表達水平。

1.9統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1lncRNA MVIH在不同結直腸癌細胞系中的表達 FHC、SW480、HT29、LOVO、SW620細胞lncRNA MVIH的相對表達量分別為1.00±0.00、1.72±0.13、1.58±0.10、1.85±0.16和2.38±0.21，5種細胞株lncRNA MVIH表達水平差異顯著(F=76.826，P=0.000)。與FHC細胞相比，SW480、HT29、LOVO和SW620細胞lncRNA MVIH表達水平均顯著升高(P<0.05)，且SW620細胞lncRNA MVIH表達水平最高(P<0.05)。故選用SW620細胞進行實驗。

2.2轉染后結直腸癌SW620細胞lncRNA MVIH的表達 與對照組相比，陰性組lncRNA MVIH表達水平無顯著差異(P>0.05)，干擾組lncRNA MVIH表達水平較對照組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3下調lncRNA MVIH對結直腸癌SW620細胞增殖 與對照組相比，陰性組24 h后增殖能力、克隆細胞數無顯著差異(P>0.05)，干擾組48 h后增殖能力、克隆細胞數均顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 下調lncRNA MVIH對結直腸癌SW620細胞克隆增殖能力的影響

2.4下調lncRNA MVIH對結直腸癌SW620細胞侵襲遷移的影響 與對照組相比，陰性組侵襲和遷移細胞數無顯著差異(P>0.05)，干擾組侵襲和遷移細胞數顯著減少(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 下調lncRNA MVIH對結直腸癌SW620細胞侵襲、遷移的影響(結晶紫，×200)

表2 各組侵襲、遷移細胞數比較個)

2.5下調lncRNA MVIH對結直腸癌SW620細胞上皮間質轉化的影響 與對照組相比，陰性組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白無顯著差異(P>0.05)，干擾組E-cadherin蛋白顯著升高，而N-cadherin和Vimentin蛋白顯著降低(P<0.05)。見圖3和表3。

圖3 Western印跡檢測Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達

表3 各組Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達水平比較

3 討 論

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，我國每年結直腸癌的新發病例和死亡病例約有25萬和14萬〔11〕。由于結直腸癌早期癥狀隱匿，多數患者就診時已為晚期，發生局部轉移，錯失手術治療的最佳時期，而針對晚期常用的化療會引起一定的副作用，且癌細胞產生的耐藥使患者5年生存率不高〔12〕。異常表達的lncRNA如lncRNA-MALAT1、ZFAS1等在結直腸癌中發揮著抑癌或致癌的重要作用，被認為是結直腸癌潛在的治療靶點〔13～15〕。研究顯示，lncRNA MVIH與腫瘤的發生發展密切相關〔16〕。Nie等〔17〕指出，lncRNA MVIH在非小細胞肺癌組織中表達升高，且其表達水平與患者預后、腫瘤的TNM分期、腫瘤大小及淋巴結轉移等密切相關；敲低lncRNA MVIH表達可通過調控基質金屬蛋白酶(MMP)-2/9抑制癌細胞增殖和侵襲。Zhuang等〔18〕報道，在膠質瘤細胞系和組織中lncRNA MVIH表達上調，lncRNA MVIH表達的改變與患者總生存率低有關；體外細胞實驗得出lncRNA MVIH表達上調可促進膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移，反之，下調lncRNA MVIH表達則抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移；lncRNA MVIH被認為是一種膠質瘤潛在的治療靶點。盡管唐曦等〔10〕指出lncRNA MVIH高表達與結直腸癌患者預后不良、生存時間短和淋巴結轉移有關，但lncRNA MVIH在結直腸癌中的作用并不清楚。本研究結果提示lncRNA MVIH可能在結直腸癌細胞中發揮著重要作用；下調lncRNA MVIH表達可抑制SW620細胞增殖、侵襲和遷移。上皮間質轉化是一種上皮細胞轉化為具有間質表型的生物過程，可賦予細胞轉移和入侵的能力，是腫瘤轉移的關鍵；上皮標志物E-cadherin表達減少及間質標志物Vimentin等表達增多是上皮間質轉化的主要特征〔19，20〕。耿宣等〔21〕研究指出，E-cadherin在結直腸癌組織中表達減少，N-cadherin和Vimentin表達增多，與腫瘤淋巴轉移、肝轉移等密切相關，被認為與結直腸癌發生發展密切相關。本研究結果提示lncRNA MVIH可通過調控細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化參與結直腸癌發生發展。