高通量測序分析鎘污染土壤原位修復中細菌群落的研究

聶衍韜,黃 聰

(中南安全環境技術研究院股份有限公司，湖北 武漢 430062)

1 引言

微生物在農田生態系統中起著至關重要的作用，它不僅作用于農作物的生長，也容易受外界環境影響而改變[1,2]。通常情況下，在農田土壤原位修復的過程中，修復處理工藝會引起微生物群落的變化，進而影響農田生態系統的穩定性[3,4]。以重金屬污染農田土壤原位修復工程為例，市面上常用的修復劑主要為無機、有機和微生物三類。眾多工程案例已證明它們對鎘(Cd)有良好的穩定作用，但是這些處理方法對Cd污染土壤中微生物的影響尚不明確。

本研究以湖北省黃石市市郊的Cd污染農田土壤為對象，采用高通量測序技術對無機、有機和微生物等3種不同土壤修復劑處理下Cd污染土壤的細菌群落進行解析，以探究細菌群落對不同土壤修復劑的響應變化，揭示不同細菌群落與有效態Cd含量的關系，期望為后續尋找新的微生物修復方法提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 土壤概況及處理工藝

Cd污染土壤來自湖北省黃石市市郊農田，土壤類型為巖泥田水稻土。經初步檢測，試驗土壤的pH值為6.5，總Cd含量為7.67 mg/kg。本試驗中使用的有機、無機和微生物修復劑分別為生石灰-海泡石混合劑(CaO≥ 34%、pH=12)、生物炭(主要成分秸稈、雞糞)和芽孢桿菌，皆為固態粉末修復劑。其中生物炭來自河南椰碳環保材料有限公司，生石灰-海泡石混合劑來自環保橋(湖南)生態環境工程股份有限公司，芽孢桿菌來自武漢豐甜生物科技有限公司。

本試驗共設計4個處理，即對照組(不進行修復處理，CK)；無機修復組(添加石灰-海泡石混合劑粉末，T1)；有機修復組(添加生物炭粉末，T2)；微生物修復組(添加芽孢桿菌粉末，T3)，每個處理分別稱取5 kg土壤，加入等量的除鹽水和土壤修復劑均勻混合，土壤修復劑添加量為1%，各處理3次重復。將各組土壤移入實驗玻璃容器中，隨后將實驗玻璃容器置于室外，模擬自然環境對土壤的影響。試驗為期30 d。

2.2 樣品收集和預處理

采用3點取樣法收集試驗后的土壤樣品(500 g)。使用2 mm篩子過濾土壤樣品，將過濾后土壤樣品分為2份，1份儲存于4 ℃下用于測定土壤中有效態Cd含量；1份儲存于-80 ℃下用于DNA提取。

2.3 土壤有效態Cd的分析

土壤有效態Cd含量采用M3溶液(HOAc-NH4NO3-NH4F-HNO3-EDTA)浸提，后采用石墨爐原子吸收分光光度法測定。

2.4 DNA提取與高通量測序

DNA提取選用PowerSoil?土壤DNA提取試劑盒，按照其說明書要求進行采集。提取后的DNA使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳試劑盒評估其提取質量。將合格的DNA委托武漢華大基因科技有限公司完成擴增細菌16S rDNA基因V3-V4區域(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和Illumina Miseq雙端測序工作。

2.5 數據分析

使用USEARCH[5]軟件在≥97%的相似度下，對獲得的序列進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)的聚類、分析。通過比對親緣關系的方法，注釋每個OTU的分類學信息[6]，比較分析土壤樣品中細菌群落結構及組成。基于OTU數據計算各土壤樣本的α-多樣性指數及各注釋水平的相對豐度。使用R軟件對有效態Cd與主要屬水平微生物的關系進行相關性分析。

有效態Cd及α-多樣性指數數據分析均采用Excel軟件(2016版本)進行處理，并使用SPSS軟件進行組間方差分析，組間差異顯著性水平P<0.05。

3 結果與討論

3.1 不同處理方式對土壤細菌群落OTUs組成及多樣性的影響

12個Illumina Miseq高通量測序土壤樣品共產生319801條優質序列，平均每個樣品18605～32003。稀釋性曲線是判斷樣品測序結果是否能夠反映樣品實際微生物信息的分析方法。如圖1所示，測序序列深度達到15000條以上，曲線趨于平坦，表明測序深度足夠覆蓋不同處理的土壤樣品中絕大多數微生物種群信息。因此，根據樣品的最低序列數進行抽平，對抽平后序列進行后續的細菌群落分析。

由表1可知，在本研究中，Chao1和ACE指數反映物種豐富度，Shannon、Simpson指數和系統發育多樣性(phylogenetic diversity,PD)指數反映物種多樣性。根據表1可知，4組土壤樣品都具有較高的覆蓋率(>99%)。CK組具有最高的Shannon指數、Simpson指數和PD指數，說明Cd污染土壤樣品具有較高的物種多樣性。除T1組外，T2和T3組Chao1指數和ACE指數(P<0.05)均顯著低于CK組，說明T2和T3組會減少土壤細菌群落的物種豐富度，這與Li等[7]的研究結果相一致。其可能的原因是，石灰-海泡石屬于無機物，主要是通過吸附作用和提升土壤的pH值以達到修復土壤的目的，短期內對細菌群落影響不大。而生物炭和芽孢桿菌處理直接作用于土壤微生物系統，提升了能穩定有效態Cd的一類細菌在系統中的優勢，從而導致了其他細菌群落的減少，綜合比較不同土壤修復劑處理后土壤細菌群落多樣性，CK>T1>T2>T3。

圖1 不同土壤修復劑處理后土壤細菌群落的稀疏曲線

表1 不同土壤修復劑處理后土壤細菌群落的α多樣性指數

3.2 不同處理方式對土壤細菌群落結構的影響

土壤微生物群落的結構容易受到重金屬含量的影響，其可作為鑒定土壤修復進展的指標之一[8]。如圖2所示，土壤樣品中前10個優勢菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、第四門(Gemmatimodota)、厚壁菌門(Firmicutes)、Myxococcota、浮霉菌門(Planctomycetota)、GAL15，其平均相對豐度分別為28.28%、21.93%、17.82%、7.03%、6.65%、4.31%、3.71%、2.37%、2.15%、1.67%。其中變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是Cd污染土壤中主要的優勢菌門，三者相對豐度之和接近70%左右。該結果與Pei等[9]的研究結果相似。

需要額外說明的是，T3組中厚壁菌門的相對豐度可達11.51%，遠高于其他組，說明外源添加的芽孢桿菌可以在含Cd土壤中定殖[10]。

如圖3可知，在屬水平上，T1組中主要的優勢菌屬與CK組的優勢菌屬的種類較為相似，但兩組中優勢菌屬的平均相對豐度存在明顯差異。T2組中觀察到Subgroup_17、Sphingomos等優勢菌屬的平均相對豐度變化顯著。T3組最主要差異在于芽孢桿菌屬(Bacillus)，其平均相對豐度分別在T3組達到11.25%。值得注意的是，norank_f_Vicimbacteraceae在T2和T3組中平均相對豐度與CK組無明顯差異，而在T1組的平均相對豐度僅為4.01%，比CK組降低了35.02%，說明石灰-海泡石處理會顯著改變norank_f_Vicimbacteraceae在土壤中的豐度，可能與石灰使得pH值呈堿性有關。

注：Others表示相對豐度<1%的微生物合集

注：Others表示相對豐度 < 1%的微生物合集

3.3 有效Cd含量與主要差異屬的關系

不同處理方式下的有效Cd含量見表2，隨后用相關性分析的方法探究不同處理的差異屬與有效Cd含量的關系。結果表明，有效Cd含量與MND1、Ellin6055、Lacunisphaera、P2-11E和UTCFX1呈正相關，無負相關的細菌屬(P<0.05)，相關系數見表3。

表3 有效Cd含量與主要差異屬的關系的相關性系數

4 結論

(1)石灰-海泡石、生物炭和芽孢桿菌的處理均會影響土壤細菌群落的多樣性，其中芽孢桿菌處理對土壤細菌群落的影響最顯著。

(2)主要優勢菌門組成為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和酸桿菌門(Acidobacteriota)，不同處理方式對主要優勢菌門結構影響差異明顯，在屬水平細菌群落組成差異較大。

(3)與有效Cd含量有關的微生物屬主要是MND1、Ellin6055、Lacunisphaera、P2-11E和UTCFX1。