非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶在發酵酒中的應用研究進展

覃秋杏，韓小雨，黃衛東，戰吉宬，游義琳,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京市葡萄科學與釀酒技術重點實驗室，北京 100083；2.中國農業大學（興化）健康食品產業研究院，江蘇 興化 225700）

釀造過程中，為了控制不同批次酒的質量穩定，多使用單一菌種發酵劑來進行發酵，目前較為常用的酵母為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母的發酵能力極強，但這也導致發酵過程中酵母多樣性下降，酵母產生的生化反應復雜程度降低，在一定程度上掩蓋了不同發酵原料之間品種和地域的差異，造成發酵酒的香氣和口感復雜度下降，帶來了酒同質化嚴重、風味趨近的問題[1]。本實驗室前期調研發現，隨著技術的發展與進步，消費者已不再滿足于傳統發酵酒的單一風味，對發酵酒風味的多樣性提出了更高的要求。消費者對于酒類多樣化的需求和單一菌株發酵帶來弊端之間的矛盾催生了關于非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）的研究。非釀酒酵母是發酵酒釀造中的非常規酵母（unconventional yeast），其發酵性能和逆境耐受能力都弱于釀酒酵母，但非釀酒酵母在發酵過程中可以分泌大量胞外酶，改善發酵酒的酒體、口感、色澤和泡沫等性質，其中非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL）（EC3.2.1.21）通過對糖苷結合態香氣物質的水解作用可以提高發酵酒的香氣復雜性。本文對發酵酒中影響β-葡萄糖苷酶活力的因素以及β-葡萄糖苷酶在不同發酵體系中的作用進行綜述，為發酵酒釀造、高β-葡萄糖苷酶活力酵母篩選和相關酵母基因編輯等研究提供參考。

1 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶是一類纖維素類水解酶，通過催化水解糖苷結合態物質中的糖苷鍵釋放香氣物質[2]。

1.1 β-葡萄糖苷酶來源

β-葡萄糖苷酶來源十分廣泛[3]，其編碼基因BGL幾乎存在于所有生物中[4]。食品中的β-葡萄糖苷酶主要來自于植物和微生物，植物源的β-葡萄糖苷酶主要位于漿果果皮中，與釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶一樣，在酒類發酵條件下（酸性（pH值3～4）、高糖含量以及一定濃度的乙醇）對于風味改善幾乎沒有作用[2,5-6]。因此目前研究的熱點在于微生物產生的β-葡萄糖苷酶，商業使用的β-葡萄糖苷酶大多來自黑曲霉（Aspergillus niger）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum），外源添加β-葡萄糖苷酶可以提高果汁的產量，改善成品酒的色澤、澄清度和品種香氣[7-8]。真菌產生的β-葡萄糖苷酶也存在一定的不足，如外源酶制劑的純度無法達到100%，因而可能引發安全性問題[9]，β-葡萄糖苷酶對色素糖苷的水解作用可能會導致揮發性酚類物質的產生，使食品產生不良風味等[7,10]。基于以上的不足，研究者開始將目光轉向其他來源的β-葡萄糖苷酶，研究發現非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶的活力較高，與霉菌產生的β-葡萄糖苷酶相比安全性高、獲取方式簡單且成本較低，因此非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶或許更適合用于發酵酒中[11]。

1.2 β-葡萄糖苷酶的作用機制

得益于其催化糖苷鍵的能力，β-葡萄糖苷酶在揮發性香氣物質的產生中發揮著重要的作用。香氣化合物在發酵酒中的存在方式有游離態和結合態，游離態的物質可以直接揮發產生香氣，而結合態的物質需水解為游離態物質后才能釋放出香氣物質[12-13]。糖苷結合態香氣物質由苷元和糖基組成，其中苷元是風味活性物質，水解后可增加發酵酒中植物、水果型香氣[14]，在酒類原料中的風味活性苷元包括中鏈烷醇和烯醇、莽草酸衍生物、苯衍生物、C13-降異戊二烯、單萜烯和倍半萜醇等[14-15]。

糖苷結合態香氣物質的水解方式包括酸水解和酶水解。在葡萄汁中，糖苷結合態香氣物質可以自發進行酸水解，釋放苷元[16-17]，使得香氣物質游離；而酶水解過程則需要酶類的參與（圖1），首先糖苷外切酶α-鼠李糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶或β-洋芹糖苷酶等作用于糖苷基末端的糖苷鍵，釋放β-葡萄糖苷，隨后β-葡萄糖苷酶作用于β-葡萄糖苷，釋放苷元和葡萄糖，游離態的苷元達到感官閾值后即可對酒的香氣做出貢獻[16,18-19]。在糖苷結合態香氣物質的水解過程中，糖苷外切酶和β-葡萄糖苷酶具有協同作用，其中β-葡萄糖苷酶是關鍵的限速酶[20-21]，發酵過程中該酶的含量與活力影響著發酵所得成品酒的風味復雜度。

圖1 β-葡萄糖苷酶作用機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the action mechanism of β-glucosidase

不同的水解方式對酒的影響不同，酸水解導致苷元發生重新排列，反應速度慢，可能會產生不良風味[15,17]；而酶水解所需的β-葡萄糖苷酶多來自原料及酵母，獲取方式簡單且酶水解反應速度快，并且非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶活力是所有酵母中最高的，可以在釀酒酵母無法產生β-葡萄糖苷酶或酶活力不足的情況下進行補充，從而提高發酵酒香氣的復雜度[22]。

2 β-葡萄糖苷酶活力的影響因素

與其他種類的酶一樣，β-葡萄糖苷酶活力也受到多種因素的影響，酵母合成和釋放β-葡萄糖苷酶的能力、發酵環境中的溫度、酸堿度和可發酵糖濃度都會對其酶活力產生影響[23]。

2.1 酵母合成和釋放β-葡萄糖苷酶的能力對β-葡萄糖苷酶活力的影響

大部分非釀酒酵母都可以合成和釋放β-葡萄糖苷酶，然而非釀酒酵母具有非常強的菌株特異性，導致菌株產生的β-葡萄糖苷酶活力存在著種間差異和種內差異，不同酵母細胞中β-葡萄糖苷酶的存在位置和聚合方式也有所不同。王佳等[24]發現不同的非釀酒酵母產生β-葡萄糖苷酶的能力不同，其中陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）和季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）產酶能力最強。對非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶進行酶活定位時發現，β-葡萄糖苷酶在酵母細胞中有細胞外、細胞內和細胞壁中3 種存在方式。在對123 株季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）中β-葡萄糖苷酶活力進行測定時，發現細胞外β-葡萄糖苷酶活力最高，73%的菌株酶活力在80～120 pNP nmol/（mL·h）（pNP表示4-硝基苯酚），而在70 株葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）中，細胞外、細胞內和細胞壁中的β-葡萄糖苷酶活力為30～40 pNP nmol/（mL·h）的菌株所占比例分別為37%、30%和29%，無論是同一菌屬或是不同菌屬，酶活定位的不同導致酶活力存在差異[13]。李愛華等[25]發現葡萄汁有孢漢遜酵母產生的β-葡萄糖苷酶為胞外酶，超聲破碎后細胞上清液中的β-葡萄糖苷酶活力遠高于其他樣品，但也有研究發現胞內β-葡萄糖苷酶活力高于胞壁結合酶活力，因此細胞中酶活定位的不同會帶來酶活力的不同，但是無法根據酶活定位來確定酶活力高低[26]。酵母細胞中β-葡萄糖苷酶有多種聚合方式，包括單聚體、二聚體、三聚體和四聚體[27]，已有研究發現在不同菌屬的細胞或同一菌屬不同菌株的細胞中，都會存在β-葡萄糖苷酶聚合方式的差異，β-葡萄糖苷酶活力也存在不同[28-29]。酵母合成和釋放β-葡萄糖苷酶的能力不同導致β-葡萄糖苷酶的活力不同再次驗證了菌株特異性對于非釀酒酵母在啤酒中應用效果的影響，也提示著發酵前菌株篩選的必要性。

釀造過程中釀酒酵母和非釀酒酵母之間會產生相互作用，導致菌株β-葡萄糖苷酶活力發生改變[30]。非釀酒酵母的發酵能力較弱，為了獲得較高的發酵度，通常會在接種非釀酒酵母的發酵液中同時或順序接種釀酒酵母[31]。在美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）和釀酒酵母共發酵葡萄酒的過程中，研究人員發現無論是混合接種還是順序接種，共發酵組中的β-葡萄糖苷酶水解產生的橙花醇和香葉醇的含量都會顯著低于美極梅奇酵母單菌發酵組[32]，徐建坤[33]也得到了類似結果，雖然混合發酵組酶活力均高于釀酒酵母單菌發酵組，但混合接種時發酵液中最高β-葡萄糖苷酶活力遠低于非釀酒酵母在最適條件下的酶活力，釀酒酵母與非釀酒酵母共發酵時產生的相互作用會影響β-葡萄糖苷酶的活力。

2.2 發酵環境對β-葡萄糖苷酶活力的影響

β-葡萄糖苷酶對環境的變化十分敏感，且不同的環境對酶活力的影響不同。

酒類的發酵溫度通常低于25 ℃，而β-葡萄糖糖苷酶的最適溫度為40～50 ℃，遠高于發酵溫度，導致β-葡萄糖苷酶在發酵溫度時的活力低于最適溫度時的活力[34]。β-葡萄糖苷酶對高溫和低溫的耐受性也并不一致，其對于高溫的耐受能力弱于低溫。本課題組前期研究發現4 株野生非釀酒酵母的最適溫度為50 ℃，溫度升高到70 ℃時β-葡萄糖苷酶的相對酶活力降低為44%，而當溫度降低為10 ℃時相對酶活力大于54%，結果顯示β-葡萄糖苷酶對低溫的耐受性更好[16]。β-葡萄糖苷酶較好的低溫耐受力可以使其在酒類的發酵溫度下維持較高的活力，獲得較好的發酵效果。

環境酸堿度的改變通過影響β-葡萄糖苷酶結構從而改變其酶活力。酸堿度改變時，酶的二級結構發生改變。β-葡萄糖苷酶的最適pH值為5.0～6.0，在最適pH值條件下，β-葡萄糖苷酶α-螺旋和β-折疊相對含量最高，無規卷曲相對含量最低（BGL1：26.7%，BGL2：23.8%，AS：24.2%），pH值降低，α-螺旋和β-折疊的相對含量減少，β-轉角和無規卷曲相對含量增加，酶活力降低[35]。對巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）Y8產生的多種酶的pH值耐受性進行檢測，發現在pH 5.0時β-葡萄糖苷酶活力最高，而當pH值為2.0時，酶活力會降低至pH 5.0時的19%，并且β-葡萄糖苷酶對于酸性環境的敏感性遠高于其他酶類[2]。在常見的發酵酒體系中，常規啤酒的pH值在4.0～5.0之間[36-37]（酸啤酒由于含有乳酸，pH值可降至3.3[38]），葡萄汁和果汁由于含有較多的果酸，pH值一般為2.0～4.0[39-40]，β-葡萄糖苷酶的高酸敏感性可能會導致其在一些pH值較低的果酒（如葡萄酒）中的作用效果較差。

發酵液中還含有大量的可發酵糖（葡萄糖、果糖和蔗糖等），其中葡萄糖對于β-葡萄糖苷酶活力有較大的影響[41]。Lopez等[18]對4 種非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶的糖耐受能力進行了研究，發現實驗菌株的β-葡萄糖苷酶活力隨著葡萄糖濃度升高而逐漸下降，當葡萄糖濃度達到200 mmol/L后活力僅為未添加葡萄糖時的20%，而果糖和蔗糖對酶活力幾乎沒有影響。葡萄糖是非釀酒酵母酒精發酵過程中不可缺少的重要糖類，但其對于β-葡萄糖苷酶活力的影響可能會導致成品酒的風味物質含量發生改變。

乙醇是酵母酒精發酵的產物，發酵過程中可發酵糖的消耗可以緩解糖類對β-葡萄糖苷酶活力的抑制作用，但乙醇含量的增加會抑制酶活力，并且乙醇對β-葡萄糖苷酶的抑制作用隨乙醇濃度的增大而增強。果酒和啤酒的酒精度較低，乙醇體積分數一般為2%～5%，此條件下對β-葡萄糖苷酶活力的抑制作用較弱[42-43]，而葡萄酒的乙醇體積分數一般大于12%，在此條件下β-葡萄糖苷酶的活力受到強烈抑制[11,44]。乙醇對β-葡萄糖苷酶活力的抑制作用隨濃度增加而增強的情況或許提示高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母對于低酒精度酒的增香更為有效。

β-葡萄糖苷酶活力的影響因素眾多，除上述因素外，發酵時間[17]、金屬離子[16]等也會導致酶活力發生改變，因此在篩選酵母或對酵母進行改造時，除了對出發菌株自身特性進行考察，還需要考慮所得實驗菌株產生的β-葡萄糖苷酶對發酵環境的適應能力。表1對部分非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶的性質進行了總結。

表1 部分非釀酒酵母來源的β-葡萄糖苷酶的性質Table 1 Properties of β-glucosidases from non-Saccharomyces yeasts

3 β-葡萄糖苷酶在發酵酒中的應用

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于非釀酒酵母中，其在假絲酵母屬（Candidasp.）、耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）、畢赤氏酵母（Pichiasp.）、有孢漢遜酵母（Hanseniasporasp.）、梅氏酵母（Metschnikowia zizyphicola）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和酒香酵母（Brettanomycessp.）等菌屬的某些菌株中具有較高的活力[45,51-53]，可用于發酵酒以提高香氣復雜度，并對酒體的顏色穩定性產生影響。

3.1 β-葡萄糖苷酶在葡萄酒中的應用

β-葡萄糖苷酶在葡萄酒中的作用不僅包括水解糖苷鍵增加香氣復雜度，部分非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶對花色苷的水解作用也會對葡萄酒的顏色產生影響。研究發現高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母可以將葡萄果實中的糖苷結合態香氣物質如單萜烯、C13-降異戊二烯和芳香族化合物等釋放出來。在本課題組前期研究中，將葡萄汁有孢漢遜酵母H30（Hanseniaspora uvarumH30）和光滑假絲酵母D18（Candida glabrataD18）與釀酒酵母順序接種于葡萄汁中進行發酵，發現這兩株非釀酒酵母都可以增加成品酒中的萜烯類物質和C13-降戊二烯類物質的含量，并且光滑假絲酵母D18可以使發酵酒中品種香種類增多[16]。高β-葡萄糖苷酶活力的季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）BF1被用于無味菲亞諾葡萄（Fiano）的發酵中，無論是BF1單菌發酵還是與釀酒酵母混菌發酵，成品酒中芳樟醇和松油烯-4-醇的含量均較高，感官評價顯示兩款酒中水果味和玫瑰花香最為突出[13]。β-葡萄糖苷酶還與葡萄酒中萜烯類物質的產生有關，王興凱[17]發現葡萄模擬汁中萜烯類物質（主要是芳樟醇、香茅醇和香葉醇）的變化與β-葡萄糖苷酶活力的變化趨勢一致，而從陸生伊薩酵母菌（Issatchenkia terricola）中分離得到的β-葡萄糖苷酶用于葡萄酒釀造時，則可以使葡萄酒中酚類物質含量增加83%，降異戊二烯化合物含量增加65%[46]。多種高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母已被證明可以用于葡萄酒的發酵，且在增加香氣物質特別是萜烯類物質和C13-降戊二烯類物質等含量方面有重要作用。

除了香氣特征外，顏色也是葡萄酒重要的屬性之一，花青素是葡萄酒中重要的色素化合物，大部分的花青素是單葡萄糖苷，部分β-葡萄糖苷酶可使糖苷鍵斷裂，游離的花青素迅速降解成無色化合物，導致葡萄酒色澤不佳甚至失色[54-56]。不同菌株產生的β-葡萄糖苷酶對花色苷的作用不同，研究者將阿薩絲孢酵母（Trichosporon asahii）所產的β-葡萄糖苷酶加入至蛇龍珠葡萄汁中進行發酵，發現β-葡萄糖苷酶對花色苷特別是飛燕草素葡萄糖苷具有較強的降解作用[35]，而在Vernocchi等[57]的研究中，將含有高β-葡萄糖苷酶活力的釀酒酵母BV12和BV14接種于桑嬌維塞（Sangiovese）葡萄汁時，并未發現這兩株酵母對葡萄酒顏色的不良影響。β-葡萄糖苷酶對于花色苷的分解作用的差異可能與底物的結構特征和β-葡萄糖苷酶的性質有關，β-葡萄糖苷酶對花色苷的分解作用也可以作為一種改變葡萄酒顏色的方法加以利用[58]。

3.2 β-葡萄糖苷酶在啤酒中的應用

啤酒中的糖苷結合態香氣物質主要來自啤酒花，酒花中含有的糖苷結合態香氣物質包括脂肪醇、萜烯醇和C13-降異戊二烯類化合物等[14,59]，這些物質在發酵過程中被水解釋放，從而改善啤酒的香氣復雜性[60]。其中，萜烯類糖苷物質的香氣閾值較低，水解時產生的萜烯類物質（如月桂烯、香葉醇、佛手柑醇和芳樟醇等）具有濃郁的花香和水果香氣[61]，單萜烯還可以進一步轉化為β-香茅醇或α-萜烯醇，增強花香味和檸檬味[62]。C13-降異戊二烯包括β-大馬士酮和β-紫羅蘭酮等，是β-葡萄糖苷酶水解產生的重要風味物質，可以產生令人愉悅的香氣[63]。

目前在啤酒發酵體系中利用非釀酒酵母產生β-葡萄糖苷酶的性質進行增香的研究較少，以酒香酵母的研究最為透徹。酒香酵母因其可以產生大量的酚類物質從而導致異味，在過去通常被認為是導致腐敗的酵母[64]，但隨著對酒香酵母研究的不斷深入，酒香酵母可以產生β-葡萄糖苷酶的特性逐漸被開發，并且發現部分菌株在發酵過程中并未產生不良風味，這也加速了酒香酵母在啤酒中的應用研究[65-66]。布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）和異酒香酵母（Brettanomyces anomalus）是啤酒發酵中較為常見的兩類酒香酵母，常用于貴茲啤酒和蘭比克啤酒的發酵中。酒香酵母產生的β-葡萄糖苷酶可以作用于酒花和麥芽，當酒香酵母作用于酒花時，可以水解釋放出酒花中含有的苷元，如芳樟醇、水楊酸甲酯、順-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇等，且水解所得苷元物質的質量濃度大于0.005 mg/L[48]。當酒香酵母作用于麥芽時，可以使得麥芽中的糖苷鍵斷裂，使麥芽中的萜烯類物質游離出來[49]。酒香酵母能否產生β-葡萄糖苷酶與其是否含有BGL1和BGL2基因有關，同時含有這兩個基因，或者僅含BGL2基因的酒香酵母具有較高的胞外β-葡萄糖苷酶活力，并且在發酵過程中酶活力高于僅含BGL1或不含BGL1和BGL2基因的酵母[67]。部分釀酒酵母中編碼外切葡聚糖酶的EXG基因也被證實具有非特異作用于葡萄糖聚合物和較小的糖基結合底物的活力[68]，高EXG活力的酵母菌株在發酵過程中對酒花糖苷也有一定的分解能力，但不同菌株之間的活力相差較大[69]，且其對于酒花糖苷的分解能力遠低于非釀酒酵母[48]，基因組成決定了釀酒酵母和非釀酒酵母是否具有產生高活力β-葡萄糖苷酶的能力。酒香酵母目前多用于特種啤酒的發酵，但隨著對其基因組學和代謝組學研究的不斷深入，其在啤酒發酵中的應用也會大大擴寬。

耐熱克魯維酵母具有較高β-葡萄糖苷酶活力的特性也被應用于啤酒發酵中，可以促進酒花中糖苷前體物質的釋放[70-71]，耐熱克魯維酵母還是一種潛在的啤酒發酵劑，在啤酒發酵中可產生乳酸降低pH值[72]，與酸啤酒發酵常用的乳酸菌相比，耐熱克魯維酵母耐受異α-酸的能力更高，更適合用于酸啤酒的發酵。耐熱克魯維酵母在發酵過程中可以產生甘油，對于改善酒體和口感有重要作用[71]。耐熱克魯維酵母在產β-葡萄糖苷酶、發酵能力、產乳酸、產甘油等方面優于其他非釀酒酵母，因此其在啤酒中的應用前景也更廣闊。

高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母種類眾多，并且大部分都在葡萄酒增香中有較好表現，但其在啤酒體系中的研究較少，布雷特酵母和耐熱克魯維酵母在啤酒增香中的作用表明高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母對于啤酒風味具有改善作用，這也側面說明其他高β-葡萄糖苷酶活力的酵母在啤酒發酵中也具有廣闊的應用前景。

3.3 β-葡萄糖苷酶在其他發酵酒中的作用

β-葡萄糖苷酶在發酵酒中的應用并不局限于葡萄酒和啤酒，在一些果酒如蘋果酒[50]、毛桃果酒[73]等發酵體系中也有相關的研究，β-葡萄糖苷酶在這些酒中的作用不僅包括增香，還可以改善酒的品質。在蘋果汁中單獨或混合接種戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）與釀酒酵母，發現混合發酵時酵母產生的β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和果膠酶的活力均高于單菌發酵時的活力，并且酶活力越高對蘋果酒香氣的改善效果越好[50]。在毛桃果酒釀造過程中由于果實顏色不一，產品會發生變色和渾濁，在發酵過程中加入β-葡萄糖苷酶后，花色素苷發生水解，毛桃果酒顏色穩定性提高[73]。在果酒發酵中使用非釀酒酵母，可以篩選和馴化適用于果酒的非釀酒酵母，隨著研究的深入，非釀酒酵母的性能開發也將更為多樣。

3.4 不同發酵體系對非釀酒酵母要求的比較

β-葡萄糖苷酶對于香氣的改善作用在葡萄酒、啤酒、蘋果酒等體系中都得到了驗證，并且不同菌株產生的β-葡萄糖苷酶活力不同，不同的發酵汁對β-葡萄糖苷酶活力的影響也不同。葡萄酒等果酒發酵汁中，含有較多的酸性物質，pH值較低，并且葡萄酒的酒精度通常較高，因此篩選用于果酒發酵的非釀酒酵母時，需要對其酒精耐受力和耐酸能力進行測試。啤酒發酵汁與以上酒類的不同之處在于其在發酵過程中加入了啤酒花，啤酒花在煮沸過程會產生異α-酸，異α-酸在酸性環境中可以抑制酵母的生長[74]，導致非釀酒酵母的延滯期延長[75]，因此用于啤酒增香發酵的非釀酒酵母除了高產β-葡萄糖苷酶外還需要具有一定的耐受異α-酸等的能力。不同發酵體系中酵母的適應性不同，因此在發酵液中接種非釀酒酵母時需先根據發酵體系中對菌株進行篩選。

3.5 獲取具有β-葡萄糖苷酶活力菌株的方法

目前獲得高產β-葡萄糖苷酶的酵母的方法有很多種，包括直接篩選、誘變育種和基因工程等（表2）。直接篩選法指從含有β-葡萄糖苷酶的基質中，通過一定的方法篩選出可以產生β-葡萄糖苷酶的酵母，牟含[76]通過七葉苷顯色法從白酒酒窖中篩選得到了多株高產β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母，并將所得非釀酒酵母用于葡萄酒增香釀造中。產β-葡萄糖苷酶的菌株來源十分廣泛，除了酒類發酵醪，各種細菌和真菌[77]以及茶樹類植物[78]也是其重要來源，因此通過直接篩選法獲得高產β-葡萄糖苷酶的菌株是一個極其普適的方法。誘變育種指利用物理或化學的方法使酵母的遺傳物質和性能發生改變的一種方法，研究人員通過常壓室溫等離子體與紫外復合誘變技術對兩株釀酒酵母進復合誘變，所得菌株產生的β-葡萄糖苷酶活力遠高于出發菌株[79]。誘變育種方法具有快速、突變率高等特點，可以在短時間內形成大量突變，因此也是獲得高β-葡萄糖苷酶活力菌株的較好方式[80]。基因工程技術是指直接在出發菌株中導入目的基因從而獲得高產所需物質菌株的方法，目前較為常用的技術為CRISPR/Cas9技術，研究人員利用該技術將酵母細胞壁蛋白Cwp2p編碼基因破壞后，使得酵母分泌的β-葡萄糖苷酶活力提高[81]。通過基因工程技術尋找與β-葡萄糖苷酶相關的靶點基因，可以達到提高出發菌株酶活力的目的。以上方法都是目前較為常用的獲取新性能酵母的方法，但是也不可避免地存在一定的不足，這也導致在進行高酶活力酵母的篩選和改造時，需要根據所需特性及不同方法的優缺點進行選擇。

表2 獲取產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株方法比較Table 2 Comparison of methods for obtaining yeast strains with β-glucosidase

4 結 語

高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母在發酵酒中的應用已經在葡萄酒、啤酒和其他發酵酒等多個發酵體系中得到驗證（圖2）。在我國傳統的酒精飲料白酒的酒曲和黃水以及黃酒的酒曲中，也有關于高產β-葡萄糖苷酶菌株的發現，研究人員將其用于葡萄酒的發酵中可以增加酒的柑橘類、甜果類、香料類香氣[86-89]。大量研究表明非釀酒酵母產生的β-葡萄糖苷酶對于發酵酒的作用包括水解糖苷結合態香氣物質，釋放C13-降異戊二烯、單萜烯、倍半萜醇和脂肪醇等增加酒類香氣的復雜度。β-葡萄糖苷酶對花色苷的水解作用也影響著酒類的顏色穩定性。部分高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母在發酵中還可以產生乳酸和甘油，改善酒的口感和風味。

圖2 β-葡萄糖苷酶活力的影響因素及其在不同發酵體系中的應用Fig 2 Factors affecting β-glucosidase activity and its application in different fermentation systems

雖然高產β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母在發酵酒中的應用研究已經取得一定的進展，但由于菌株特異性以及β-葡萄糖苷酶活力的影響因素眾多等原因，導致其在實際應用中仍存在一些問題。商業釀酒酵母是一種常用的發酵劑，在多種發酵環境中都具有較好的發酵能力，而非釀酒酵母并非普適性的發酵劑，其在不同發酵體系和發酵條件的適用性還有待驗證。對于大部分非釀酒酵母而言，由于其本身對于發酵環境更為敏感，并且發酵能力較弱，因此在發酵體系和發酵條件發生改變時，適用于新環境的非釀酒酵母需要進行改造或重新篩選。非釀酒酵母雖然已經被廣泛研究，但其并不是被長期使用的公認安全的酵母，由于其會產生異味等性質，在過去甚至被認為是腐敗酵母[42]，部分非釀酒酵母本身是一種病原體，在發酵中可能會導致食品安全問題[49]，因此非釀酒酵母本身以及產生的物質的生物安全性還需要進一步驗證。目前除了自然發酵酒外，大部分非釀酒酵母在發酵酒中的應用處于實驗室階段，而高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母在發酵酒中的應用研究才剛剛起步，實現產業化還有漫長的發展歷程。

微生物產生的β-葡萄糖苷酶不僅可以應用于酒類的增香，在速溶茶增香[21]、食品脫苦[90]、白藜蘆醇生成[29]、異黃酮糖苷轉化為異黃酮苷元[91]、土壤改善[92]、病蟲害防治[93]等方面都有著良好的應用前景，無論是通過從自然基質中篩選獲得含有β-葡萄糖苷酶的菌株，或是通過誘變育種和基因工程的方法改造從而獲得高酶活力菌株，隨著代謝組學和全基因組測序研究的不斷深入，將β-葡萄糖苷酶用于工業生產是其未來發展的重要方向。