微生物組技術(shù)在果蔬采后領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

張鴻雁，雷興夢(mèng)，荊佳伊，鄧麗莉,2，易蘭花,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

目前關(guān)于大多數(shù)果蔬生物防治的研究都集中在單一拮抗菌對(duì)病害的防治效果以及機(jī)理研究上，實(shí)際效果并不理想。第二代測(cè)序的出現(xiàn)使得不可培養(yǎng)微生物的研究成為可能，由此本文闡述了通過擴(kuò)增子和宏基因組測(cè)序的方法所得的采后果蔬微生物的概況，同時(shí)綜述了各種環(huán)境因子和外界干預(yù)措施對(duì)果蔬微生物群落的影響，從而為組建核心微生物群落并應(yīng)用于果蔬生物防治提供可行、成本低廉、效果持久的新方式。

1 微生物組技術(shù)概述

1.1 微生物組相關(guān)技術(shù)概念

隨著微生物群落分析技術(shù)的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量專業(yè)詞匯，這些詞匯在沒有明確的定義之前易造成混淆和混亂，比如微生物組（microbiome）、微生物群（microbiota）、宏基因組（metagenome）和宏基因組學(xué)（metagenomics）等詞匯的誤用會(huì)造成對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤解，因此有必要正確理解微生物組相關(guān)詞匯的定義[1]。

微生物組的定義是基于生物群系，即特定環(huán)境中的生物和非生物因素，指的是整個(gè)棲息地，包括微生物（細(xì)菌、古生菌、低等和高等的真核生物和病毒）和基因組，以及周圍的環(huán)境條件[1-2]。微生物群是指存在于特定環(huán)境中的微生物的集合，其分析是針對(duì)給定生物樣本中擴(kuò)增并測(cè)序的16S rRNA、18S rRNA或其他標(biāo)記基因和基因組區(qū)域[2]。宏基因組是將環(huán)境樣品作為遺傳學(xué)材料進(jìn)行研究。宏基因組學(xué)描述的是宏基因組的過程，從這個(gè)過程中可以獲得有關(guān)微生物群落潛在的功能信息，它是指從一個(gè)微生物群的成員中收集基因組和基因，這種收集是通過從樣本中提取DNA進(jìn)行鳥槍法測(cè)序，然后裝配或映射到參考數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行注釋獲得。關(guān)于微生物群、宏基因組及微生物組三者間的區(qū)別如圖1所示。

圖1 微生物群、宏基因組和微生物組的定義[2]Fig.1 Definition of microbiota, metagenome and microbiome[2]

1.2 研究微生物組的方法

經(jīng)典微生物學(xué)的研究方法是根據(jù)目標(biāo)微生物使用不同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在不同的生長(zhǎng)條件下從環(huán)境中分離和培養(yǎng)微生物。該方法可以獲得微生物的純凈培養(yǎng)物，但依賴于培養(yǎng)的技術(shù)會(huì)錯(cuò)過環(huán)境中絕大多數(shù)微生物[3]。近年來(lái)在微生物學(xué)中使用了許多與培養(yǎng)無(wú)關(guān)的分子技術(shù)，如測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)的發(fā)展使得不可培養(yǎng)微生物的研究成為可能。目前微生物組的研究方式包括培養(yǎng)組學(xué)、擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組測(cè)序、宏病毒組測(cè)序和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[4]。其中基于DNA層面的擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序是最常用的兩種測(cè)序方式。擴(kuò)增子測(cè)序[5-6]和宏基因組測(cè)序[7-8]方法的比較如表1所示。

微生物組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如對(duì)植物微生物[9-12]、植物根系微生物[13]、人體腸道微生物[14]、活性污泥微生物[15]、海洋微生物[16]和土壤微生物[17]等的測(cè)序分析。而目前對(duì)采后果蔬微生物的分析也處于起步階段[18]。新鮮的水果和蔬菜可以掩藏大量微生物。但是，大多數(shù)與農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)的微生物研究都集中在少數(shù)幾種病原菌上以及部分單一的拮抗菌上，因此，對(duì)果蔬中存在的微生物群落的整體多樣性和組成了解得很少。而微生物組研究技術(shù)為我們提供了一條有效的研究途徑。微生物組測(cè)序直至呈現(xiàn)最終結(jié)果是一個(gè)復(fù)雜的過程，隨著該技術(shù)的發(fā)展和推廣，有必要對(duì)微生物組測(cè)序的整體流程做一個(gè)了解。

1.3 微生物組測(cè)序流程

以擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組的整體測(cè)序流程為例，將所了解的微生物組分析流程繪制成圖2[19-21]。

2 采后果蔬微生物組的分析目的與意義

采后果蔬表面和其組織內(nèi)部存在大量微生物，其中果蔬組織附近或果蔬表面的微生物被視為附生微生物，而果蔬中的微生物，都被視為內(nèi)生微生物[3]。這些微生物已經(jīng)成為果蔬的一部分，且可以與其寄主果蔬建立各種親密的有益、中性或有害的關(guān)系。部分有害微生物會(huì)引起果蔬病害，最終導(dǎo)致果蔬腐爛，造成經(jīng)濟(jì)損失；部分有益微生物能夠抑制或殺死有害微生物，防治果蔬侵染性病害，從而出現(xiàn)了生物防治的新型病害控制方式[22]；除了部分有害/有益微生物，果蔬上存在的大部分微生物是不致病的，且其在果蔬采后病害的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，還可能影響果實(shí)的成熟和衰老[18]，但其在采后果蔬上的具體功能和作用目前為止尚不清楚，探索和了解這部分“未知”功能的微生物有助于對(duì)采后生物防治的進(jìn)一步理解并為新的生物防治策略提供思路[23]。

同時(shí)，一些環(huán)境因子或干預(yù)措施也可能會(huì)影響果蔬上的這些微生物，環(huán)境因子諸如果蔬種植地理位置、氣候條件、果蔬采后貯藏溫度和濕度等，以及果蔬采后分級(jí)、清洗和處理等干預(yù)措施均會(huì)使果蔬上存在的微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度發(fā)生變化，因此首先有必要了解并明確發(fā)育和采后的果蔬內(nèi)生和附生微生物的種類、結(jié)構(gòu)和功能作用，其次微生物隨時(shí)間推移（采后運(yùn)輸貯存過程中）的變化情況，以及不同環(huán)境因子和干預(yù)措施對(duì)采后果實(shí)上微生物群落的功能和動(dòng)態(tài)變化的影響有待研究，不同階段微生物與宿主之間的相互作用需深入解讀，這些方面的研究將促進(jìn)微生物組應(yīng)用方面的進(jìn)展，為開發(fā)安全、有效且基于功能的商業(yè)化生物防治產(chǎn)品提供有價(jià)值的信息，為生物防治提供獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。果蔬微生物組表現(xiàn)出很大程度的可塑性，可以通過采前或采后的管理實(shí)踐進(jìn)行修飾，同時(shí)果蔬上也存在不受外界因素干擾的核心微生物群落，該核心群落功能具有多樣性，且相互間存在有益的相互依存關(guān)系，而了解和使用這部分核心微生物群落，可以更好地控制采后果蔬病害的發(fā)生。

3 微生物組技術(shù)在采后果實(shí)中的研究進(jìn)展

果實(shí)中存在許多微生物，或存在于果實(shí)表面，或存在于果實(shí)組織中，部分有益微生物已被分離用于果實(shí)的生物防治，但其效果有限。果實(shí)采后微生物群落的變化實(shí)際是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，很多微生物群落與果實(shí)之間存在復(fù)雜的相互作用，因此應(yīng)重新評(píng)估單一拮抗菌生物防治效果，并全面地了解水果微生物組的動(dòng)態(tài)和功能，以設(shè)計(jì)更好的生防系統(tǒng)。研究者們可采用微生物組學(xué)技術(shù)有效監(jiān)測(cè)果實(shí)在生長(zhǎng)以及供應(yīng)鏈期間病原微生物的變化，明確侵染的關(guān)鍵點(diǎn)，從而提出適宜的病害控制策略。而要達(dá)到通過微生物群落來(lái)控制采后病害的目的，首先要對(duì)果蔬表面和內(nèi)生微生物的菌群多樣性以及功能等有一個(gè)系統(tǒng)的了解。

3.1 微生物組樣品采集

隨著研究的深入，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)多種果實(shí)中的微生物具有多樣性。在研究果實(shí)微生物多樣性時(shí)，樣品采集是一個(gè)很重要的過程，根據(jù)研究目的不同，所采集的樣品及采樣方式都是不同的。在研究果實(shí)表面附生微生物時(shí)，要對(duì)果實(shí)進(jìn)行擦拭、洗滌、振蕩、超聲來(lái)采集微生物樣品[24-26]；而在研究果實(shí)內(nèi)生微生物時(shí)，通常將果實(shí)洗滌消毒除去附生微生物，然后采集果肉等部分的樣品[27-28]。之后提取樣品中的DNA用于測(cè)序，目前大多數(shù)的

DNA提取和純化均使用試劑盒[24-26,29-30]。使用試劑盒基本依賴于相同的過程：1）機(jī)械破壞組織；2）高濃度鹽溶解細(xì)胞膜，將核酸釋放到溶液中并防止靜電和核酸與污染物的結(jié)合；3）去除固體殘留物；4）核酸與固體基質(zhì)的選擇性結(jié)合，或選擇性沉淀核酸并通過離心沉淀；5）洗去污染物；6）洗脫/溶解核酸[31]。對(duì)于果實(shí)中微生物的取樣、DNA提取、研究目的以及最終結(jié)果進(jìn)行歸納總結(jié)如表2所示。

表2 采后果實(shí)中微生物組的研究Table 2 Recent studies on the microbiome in postharvest fruits

3.2 果實(shí)微生物群落概況

對(duì)果實(shí)微生物群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性的總體了解是進(jìn)行具體深入研究的基礎(chǔ)。研究采后蘋果附生真菌時(shí)結(jié)果表明子囊菌占所觀察物種的90%以上，其次是擔(dān)子菌（8%）和壺菌（0.1%）[29,33]。Angeli等[24]通過鳥槍法測(cè)序在分類和功能水平上表征蘋果表面的微生物群落，結(jié)果表明附生在蘋果果實(shí)表面的真菌和細(xì)菌的多樣性非常高，且真菌序列的比例（79.0%）高于細(xì)菌序列的比例（13.8%），其中真菌以子囊菌門為主，擬桿菌門次之。Piombo等[34]分析了椰棗果實(shí)不同發(fā)育階段果肉和果皮中微生物種群的差異，結(jié)果表明青霉菌屬、枝孢屬、曲霉屬和鏈孢霉屬在果實(shí)中分布最為豐富，但在時(shí)間點(diǎn)和組織類型（果皮與果肉）上分布差異較大。內(nèi)生微生物是與果實(shí)相關(guān)的微生物群的一部分，這些微生物與宿主已經(jīng)建立了密切的聯(lián)系。Compant等[35]早在2011年對(duì)自然條件下栽培的葡萄植株的花、果實(shí)、種子中的內(nèi)生菌分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些器官被各種內(nèi)生菌定植，且這些組織中明顯存在厚壁菌門。隨后在2012年Krishnan等[36]從4 個(gè)品種的木瓜果實(shí)中分離培養(yǎng)得到18 株內(nèi)生菌，其中芽孢桿菌是跨木瓜品種的主要細(xì)菌內(nèi)生菌；木瓜果實(shí)的種子和內(nèi)果皮中含有考克氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬和腸桿菌屬。同年Jensen等[37]對(duì)草莓上可培養(yǎng)的微生物群落水平進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示健康草莓表面上微生物群是復(fù)雜的，包括潛在的植物致病菌、條件致病菌、植物病害生物拮抗菌和產(chǎn)真菌毒素的病原菌（以青霉菌為主），所分離的微生物中細(xì)菌是草莓菌群中最豐富、最多樣化的菌群，其次是酵母和絲狀真菌，分析發(fā)現(xiàn)草莓菌群與栽培實(shí)踐無(wú)明顯相關(guān)性。通過rDNA ITS2區(qū)域的擴(kuò)增子測(cè)序的方法對(duì)草莓中真菌多樣性研究，結(jié)果表明葡萄孢屬和枝孢屬是優(yōu)勢(shì)菌屬，一些常見的草莓病原體卻豐度較低或未被檢測(cè)到[38]；而Zhang Houpu等[39]的研究結(jié)果表明腸桿菌在草莓的內(nèi)生微生物組中占主導(dǎo)地位。芒果中真菌和細(xì)菌群落的變化均取決于果皮的顏色（抗性（紅皮）和易感（綠皮））、貯藏時(shí)間和貯藏溫度[27]；Galsurker等[40]研究還發(fā)現(xiàn)采收時(shí)帶短莖的芒果具有較高的抗真菌和抗氧化活性，且保持了更健康的微生物群落。Saminathan等[28]對(duì)不同品種西瓜果肉中的微生物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，西瓜的品種反映了微生物組的數(shù)量和多樣性差異，細(xì)菌多樣性在所有樣品中均比較低，變形桿菌是所有樣品中轉(zhuǎn)錄活性最高的菌群，變形桿菌可能在成熟的西瓜果實(shí)中起主要作用。假單胞菌科家族成員是西瓜中的內(nèi)生微生物，成熟西瓜中存在不同種類的微生物，表明不同種類細(xì)菌在成熟階段的重要作用是通過其代謝活性和糖代謝中的基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮的。

3.3 環(huán)境因子介導(dǎo)下的果實(shí)微生物組變化

天然微生物組是復(fù)雜的，通常由數(shù)百個(gè)不同的群體以未知的方式進(jìn)行交互作用。微生物組通常對(duì)一些環(huán)境因子表現(xiàn)出不可預(yù)測(cè)的響應(yīng)。一些生物條件會(huì)影響植物微生物的分布，除了植物組織表面和內(nèi)部，不同生態(tài)位的微生物群落也是不同的，且占據(jù)不同宿主同一生態(tài)位的微生物群落可能也會(huì)存在差異，非生物條件（例如溫度、濕度和pH值）也會(huì)直接或間接地通過宿主對(duì)微生物組產(chǎn)生廣泛影響[3]。在研究采后果實(shí)中的微生物時(shí)，除了以上因素外，還要充分考慮采前/采后處理、果實(shí)的成熟與衰老程度、包裝和貯藏條件、腐爛和病害發(fā)生情況[18]等對(duì)果實(shí)中微生物群落分布的影響。

有研究調(diào)查了管理實(shí)踐對(duì)果實(shí)微生物群落組成的影響，微生物群隨時(shí)間變化以及采摘、加工、運(yùn)輸?shù)疆?dāng)?shù)爻械汝P(guān)鍵環(huán)節(jié)對(duì)微生物組成的影響。Abdelfattah等[29]發(fā)現(xiàn)采后蘋果真菌微生物區(qū)系的α和β多樣性（樣本復(fù)雜度分析）在果實(shí)不同部分之間有顯著差異。主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）表明，樣品的微生物群基于蘋果的不同部位（例如果皮、傷口處、花萼末端或莖末端組織）明顯聚集；該結(jié)果表明，在設(shè)計(jì)用于控制采后疾病的生物防治系統(tǒng)時(shí)，需要考慮蘋果果實(shí)不同部分相關(guān)的微生物群落。從有機(jī)果園和常規(guī)管理方式的果園采摘的蘋果上明顯存在不同的真菌種群，并且有機(jī)管理的蘋果中存在幾種獨(dú)特的分類單元，可能與種植蘋果的管理實(shí)踐方式有關(guān)。在檢測(cè)到的真菌中，青霉菌在果皮樣品和損傷果肉樣品中占主導(dǎo)地位，而交鏈孢菌在花萼和莖端樣品中普遍存在。Shen Youming等[26]研究了果園地理位置對(duì)果實(shí)真菌群落的影響，研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)村果園樣品真菌多樣性要高于城郊果園樣品，且農(nóng)村果園蘋果樣品表面上保持了更多的真菌群落，而城郊果園種植的蘋果則具有潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)。以上結(jié)果表明果園位置、果園管理方式、果實(shí)不同部位、果實(shí)的貯藏時(shí)間和機(jī)械損傷等均會(huì)對(duì)蘋果果實(shí)的微生物群落造成影響。Bokulich等[30]在研究葡萄果汁的微生物時(shí)也發(fā)現(xiàn)，葡萄園和葡萄栽培區(qū)域、葡萄品種和當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件均會(huì)對(duì)葡萄酒發(fā)酵前微生物的組成產(chǎn)生影響。魏玉潔等[32]研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄中細(xì)菌以假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和水黏結(jié)桿菌屬（Adhaeribacter）為主，真菌以短梗霉屬（Aureobasidium）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、曲霉屬（Aspergillus）和有孢酵母菌屬（Sporospora）為主；微生物的多樣性會(huì)因葡萄園地理位置不同而存在差異。此外，Taylor等[41]對(duì)4 個(gè)主要地區(qū)葡萄真菌群落的豐富度和組成研究發(fā)現(xiàn)，所有地區(qū)微生物在多樣性方面都互不相同。另一項(xiàng)研究表明，土壤是葡萄相關(guān)細(xì)菌的主要來(lái)源，土壤因素、地理因素和葡萄園管理會(huì)影響葡萄的采前微生物群落[42]。

3.4 外源干預(yù)措施對(duì)果實(shí)微生物組的影響

微生物組通常對(duì)約束或脅迫，以及其他干預(yù)措施表現(xiàn)出不可預(yù)測(cè)的響應(yīng)。Gomba等[25]通過微生物培養(yǎng)法和焦磷酸測(cè)序的方法研究了貯藏條件、殺菌劑處理、乙烯褪綠等采后處理方式對(duì)‘帕爾默’臍橙和‘克萊門氏’小柑橘果實(shí)微生物組的影響，研究者采集了5 種類型的樣品：新鮮采收果實(shí)、殺菌劑浸泡果實(shí)、殺菌劑浸淋后乙烯褪綠果實(shí)、殺菌劑浸淋后非乙烯褪綠果實(shí)、在常溫保存褪綠（2～3 d）果實(shí)（未經(jīng)殺菌劑浸淋和乙烯褪綠），研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)微生物會(huì)因果實(shí)品種不同而出現(xiàn)差異，主要在于果實(shí)表面的平整度，果實(shí)表皮粗糙不平坦有利于微生物的定植；測(cè)序結(jié)果顯示，與殺菌劑浸淋和未經(jīng)處理的果實(shí)相比，新鮮采收和褪綠處理樣品的細(xì)菌群落更為相似，說(shuō)明洗滌和褪綠的干預(yù)措施都會(huì)改變果實(shí)表面菌群的自然生態(tài)平衡，并阻止形成微生物群落；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)已知含有潛在人類病原體的細(xì)菌屬在柑橘果實(shí)表面定植。菌落計(jì)數(shù)和焦磷酸測(cè)序分析表明，褪綠前浸淋殺菌劑大大降低了果實(shí)表面真菌物種的豐富度和多樣性。盡管浸淋殺菌劑導(dǎo)致微生物種群顯著減少，但在乙烯褪綠過程中這些種群得以恢復(fù)，說(shuō)明微生物轉(zhuǎn)移不是永久性的。在褪綠期，采摘未處理樣品的微生物多樣性最高；因此建議在采摘后立即對(duì)果實(shí)清洗和消毒。熱處理是可以降低果實(shí)采后腐爛的方法，Wassermann等[43]研究發(fā)現(xiàn)熱處理在商業(yè)條件下顯著減輕蘋果腐病癥狀，對(duì)蘋果真菌菌群的影響不大，對(duì)細(xì)菌群落的影響不顯著；而病原菌侵染顯著降低了蘋果的細(xì)菌和真菌多樣性，相對(duì)于病原菌侵染的蘋果果實(shí)，貯存的健康蘋果所含有的18 個(gè)細(xì)菌和4 個(gè)真菌類群是患病蘋果所沒有的，從而作者定義了一種與健康相關(guān)的采后微生物群，應(yīng)用熱處理和由迷走泛菌（Pantoea vagans14E4）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens14C9）和副乳假單胞菌（Pseudomonas paralactis6F3）組成的生物菌群防治聯(lián)合的方法可以有效地減少兩種采后病原菌。Abdelfattah等[44]研究了采后洗滌和打蠟處理及低溫保存對(duì)不同蘋果組織（花萼末端、莖末端和果皮）中相關(guān)的真菌和細(xì)菌群落的影響，結(jié)果表明，組織類型是決定蘋果果實(shí)真菌和細(xì)菌多樣性以及群落組成的主要因素，對(duì)蘋果僅進(jìn)行清洗會(huì)大大減少果皮和莖端組織上的微生物多樣性，而不會(huì)影響花萼端組織，花萼端組織微生物多樣性僅受到打蠟處理的影響；低溫貯藏結(jié)果表明蘋果果實(shí)上的真菌多樣性易隨時(shí)間變化，而貯存時(shí)間對(duì)細(xì)菌多樣性的影響并不明顯。加入外源拮抗菌株也會(huì)影響果實(shí)微生物群落，Liu Xia等[45]研究發(fā)現(xiàn)拮抗酵母庫(kù)德畢赤酵母菌（Pichia kudriavzevii）處理降低了圣女果在貯藏過程中葡萄孢屬（Botrytis）和鏈格孢屬（Alternaria）的豐度，從而改變圣女果附生微生物群落的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步說(shuō)明了功能上的相似性相對(duì)于分類學(xué)上的相似性更能夠影響真菌群落的發(fā)育。Fang Xiang等[46]在研究德氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）防治草莓果實(shí)采后腐爛中發(fā)現(xiàn)，與真菌相比，德氏乳酸桿菌和乳酸明串珠菌對(duì)細(xì)菌物種的抑制作用明顯更大，說(shuō)明用生物防治劑進(jìn)行特殊處理可能使微生物群落轉(zhuǎn)變?yōu)楦】岛头€(wěn)定的狀態(tài)，從而延長(zhǎng)了果實(shí)的可存儲(chǔ)性[47]。

在農(nóng)業(yè)種植中，從包括污染的土壤、灌溉水、動(dòng)物和糞便在內(nèi)的各種來(lái)源引入的微生物都可能成為果實(shí)表面微生物群落的一部分。地理區(qū)域、植株年齡和耕作方式等多種因素會(huì)影響果實(shí)表面微生物形成的能力[25]。以上研究還說(shuō)明果實(shí)的不同部分具有一系列細(xì)菌內(nèi)生菌，它們可能是賦予果實(shí)高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的重要因素，且與果實(shí)相關(guān)的微生物群落可能在其寄主植物的抗病性中起著特殊的作用，可以用作果實(shí)生長(zhǎng)及采后的生物防治劑，果實(shí)中既含有有益微生物，又含有致病微生物，果實(shí)上的有益細(xì)菌是尚未開發(fā)的資源，無(wú)論是附生菌還是內(nèi)生菌，都可以作為果實(shí)重要病原體的拮抗劑進(jìn)行進(jìn)一步探索，并有可能發(fā)展為有效的生物防治劑[32]。這樣不僅在田間而且還可以在采后保護(hù)果實(shí)免受微生物侵染，還可能通過延遲軟化和變質(zhì)來(lái)延長(zhǎng)果實(shí)的保質(zhì)期，確保食品安全。原生果實(shí)菌群都具有高度的多樣性，這些特性對(duì)植物和人類健康都具有重要意義。

4 微生物組技術(shù)在采后蔬菜中的研究進(jìn)展

除了果實(shí)微生物，蔬菜上的相關(guān)微生物也備受關(guān)注，蔬菜是一類加工處理較少的農(nóng)產(chǎn)品，通常微生物會(huì)黏附在蔬菜葉片表面，并向蔬菜組織滲透，它們?cè)诩庸ず蟊Ａ袅舜蟛糠直镜匚⑸飬^(qū)系，其中大部分微生物是未知的，因此蔬菜可作為傳播人類病原體的媒介，這可能造成在后續(xù)的貯藏過程中發(fā)生侵染性病害或構(gòu)成潛在的食品安全問題，且研究表明大約有30%的新鮮蔬菜變質(zhì)主要是由于細(xì)菌的定植[48]。因此通過一定的手段了解蔬菜微生物的分布及多樣性，對(duì)防治蔬菜侵染性病害、提高蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品的安全性有著重大作用。

新鮮的蔬菜可以掩藏大量微生物，經(jīng)常以生食消費(fèi)的產(chǎn)品類型受到廣泛關(guān)注，因?yàn)榕c熟食相比，生食時(shí)可能會(huì)接觸更多的活體病原菌。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，蔬菜中發(fā)現(xiàn)的那些微生物群落的整體多樣性和組成以及這些微生物的結(jié)構(gòu)開始逐漸被了解。不同蔬菜微生物的研究方法、取樣方式、研究目的及結(jié)果等的系統(tǒng)整理如表3所示。

表3 采后蔬菜中微生物組的研究Table 3 Recent studies on microbiome in postharvest vegetables

4.1 環(huán)境因子介導(dǎo)下的蔬菜微生物組變化

不同環(huán)境因子對(duì)蔬菜上微生物群落有不同程度的影響。Rastogi等[53]對(duì)長(zhǎng)葉萵苣葉片表面的微生物進(jìn)行培養(yǎng)和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序，結(jié)果顯示細(xì)菌總數(shù)平均為每克組織105～106個(gè)，而可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量平均低一個(gè)（夏季）或兩個(gè)（冬季）數(shù)量級(jí)，地理位置和季節(jié)的變化會(huì)使葉片表面微生物的群落組成有一定差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在屬水平上，在所有樣本中都發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、馬氏菌屬和節(jié)桿菌屬，與采樣地點(diǎn)和采樣日期無(wú)關(guān)。這表明它們?cè)谌n苣葉上形成了細(xì)菌核心菌群。栽培方式對(duì)蔬菜中微生物的多樣性也有一定的影響。Glassner等[54]發(fā)現(xiàn)野生和栽培的葫蘆其定植的內(nèi)生菌數(shù)量和類型存在著很大的差異，芽孢桿菌是內(nèi)生菌在葫蘆科植物果實(shí)上的主要優(yōu)勢(shì)屬，更有趣的是，研究者分離的幾種細(xì)菌菌株對(duì)植物病原菌表現(xiàn)出拮抗作用。

4.2 外源干預(yù)措施對(duì)蔬菜微生物組的影響

影響蔬菜中微生物分布和多樣性的干預(yù)措施包括多種加工處理方式，如在研究萵苣中的細(xì)菌時(shí)，研究者采集了包括原材料和切塊后、洗滌后、旋轉(zhuǎn)干燥后的萵苣樣品，通過培養(yǎng)法和16S rRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落的相對(duì)豐度沿加工鏈發(fā)生了變化，洗滌水被污染，設(shè)備操作不當(dāng)，以及加工過程中的交叉污染都可能導(dǎo)致新鮮農(nóng)產(chǎn)品受到污染，也可能是改變加工鏈微生物群落的原因；假單胞菌科是萵苣中加工鏈上的主要細(xì)菌，可能還存在產(chǎn)生抗生素抗性或多重抗性的病原體[49]。此外，對(duì)經(jīng)不同加工處理的菠菜的細(xì)菌變化及組成研究發(fā)現(xiàn)，包裝菠菜在冷藏條件（4 ℃）下貯存細(xì)菌群落的豐度、多樣性和均勻性降低。在4 ℃和10 ℃下冷藏貯存，貯存1 d后，菠菜微生物組的豐度從11 個(gè)門減少到5 個(gè)門；在這兩個(gè)溫度下保存15 d后，假單胞菌屬和腸桿菌科成員最多。4 ℃條件能夠抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，因此新鮮包裝菠菜的溫度較為重要[50]。Chen Junran等[55]在研究蒜苔在運(yùn)輸及貯藏過程中微生物群落變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在采后短期運(yùn)輸過程中，0 ℃運(yùn)輸?shù)臉悠放c15 ℃以及25 ℃運(yùn)輸?shù)臉悠氛婢鄻有源嬖陲@著差異，在0 ℃運(yùn)輸?shù)乃馓φ婢郝渑c田間保持相同的多樣性水平，而較高的溫度減少了真菌物種的數(shù)量，較高的溫度可以通過提高真菌的生長(zhǎng)代謝率來(lái)導(dǎo)致真菌之間的競(jìng)爭(zhēng)，減少競(jìng)爭(zhēng)性微生物多樣性可能會(huì)促進(jìn)存活病原體的生長(zhǎng)。說(shuō)明有必要選擇較低的運(yùn)輸溫度來(lái)抑制蒜苔上真菌的生長(zhǎng)和維持菌群。在0 ℃貯藏前期主要的優(yōu)勢(shì)菌群為隱球菌屬（Cryptococcus），但貯藏后期葡萄孢屬（Botrytis）為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明在貯藏后期除葡萄孢屬（Botrytis）以外其他真菌的生長(zhǎng)受到了抑制。除了加工方式和貯運(yùn)條件，是否被真菌感染也會(huì)極大地影響蔬菜中微生物的分布，如在研究甜菜中的微生物情況時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)甜菜不同生長(zhǎng)期內(nèi)生細(xì)菌的多樣性差異明顯，在蓮座形成（109 個(gè)）和塊莖生長(zhǎng)（146 個(gè)）期間檢測(cè)到最多的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），在幼苗生長(zhǎng)和蔗糖積累過程中，內(nèi)生細(xì)菌的多樣性降低，而植物基因型和植物生長(zhǎng)期是影響內(nèi)生菌群落動(dòng)態(tài)的主要因素[51]。研究者采集了健康/不同程度真菌感染的甜菜樣品，通過擴(kuò)增子測(cè)序發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌群落的變化與貯藏期間腐爛發(fā)生率有關(guān)，腐爛甜菜微生物組中的主要病原菌為假念珠菌屬、青霉菌屬等真菌類群以及革蘭氏陽(yáng)性乳酸菌屬[52]。該研究確定了反映甜菜腐爛和糖損失的不同指示種，為開發(fā)下一代采后管理技術(shù)提供了基礎(chǔ)。

5 合成群落在果蔬采后中的應(yīng)用潛力

目前采后果蔬病害生物防治常用的方法是鑒定和分離能夠在損傷果實(shí)組織中快速繁殖的單一拮抗劑，其在使用過程中出現(xiàn)了以下缺點(diǎn)：1）單一拮抗菌病害控制水平不一致且具有可變性；2）引入的單一拮抗劑不是系統(tǒng)中唯一的參與者，總體上拮抗劑是作為微生物網(wǎng)絡(luò)的一部分以及作為生物系統(tǒng)的組成部分而起作用；3）有效、經(jīng)濟(jì)可行的生防產(chǎn)品開發(fā)進(jìn)展甚微。生物防治研究?jī)H集中于少數(shù)病原體和有限的有益微生物，因此，重要的是將病害控制分析的寬度擴(kuò)展到植物整個(gè)微生物群。了解微生物種群及其植物宿主和非生物環(huán)境之間的相互作用可以為更好地管理和應(yīng)用對(duì)植物健康至關(guān)重要的微生物群落開辟新的機(jī)會(huì)[56]。

在自然系統(tǒng)中，單個(gè)物種并未占據(jù)環(huán)境中的所有生態(tài)位，而是多個(gè)物種共存并發(fā)揮互補(bǔ)作用，從而形成了復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)；且微生物群落不是隨機(jī)聚集的，而是年復(fù)一年地以相似的模式一致地在生物體上建立起來(lái)的，即在生物體上存在一個(gè)核心微生物群落，該核心微生物在空間、時(shí)間以及在健康植物部分器官之間可持續(xù)且可重復(fù)地建立[57]。因此使用天然的、與果蔬相關(guān)的微生物，即與給定宿主系統(tǒng)相關(guān)的核心微生物群落，可以賦予果蔬比單一拮抗劑更有效的保護(hù)。合成群落中每個(gè)微生物都具有專門的子功能，可以與總體種群中其他物種的功能協(xié)同作用[58]，可將有益于果蔬的核心微生物群落信息進(jìn)行整合，將其組裝成一個(gè)簡(jiǎn)化但又具有代表性的合成微生物群落模型，在宿主上接種明確定義的微生物群落，從而在果蔬采后生物防治中得到有益的應(yīng)用。

當(dāng)前合成群落的研究受到物種之間相互作用及組合復(fù)雜性的限制[59]，鑒于微生物群落通常是高度多樣化的，并且對(duì)實(shí)際生產(chǎn)系統(tǒng)中對(duì)大多數(shù)微生物分類單元功能的了解有限，因而通常所選擇的微生物合成群落候選成員首先具有能夠成功定植宿主的潛力，可以為調(diào)節(jié)植物抗病性提供新途徑，旨在提高作物產(chǎn)量和/或可持續(xù)性[56]。全面的微生物培養(yǎng)物收集是建立合成群落的前提，從而在生物合成條件下重建合成群落。其次，合成群落的設(shè)計(jì)組裝策略包括根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育、根據(jù)OTUs分類、根據(jù)相互作用網(wǎng)絡(luò)或根據(jù)特定功能選擇菌株。盡管該生物合成條件是人工的，但要盡可能模擬自然環(huán)境或其特征，因此合成群落應(yīng)該以16S/18S rRNA基因?yàn)閰⒖迹M相應(yīng)的不可培養(yǎng)依賴性群落[57]。后續(xù)研究中還可以解剖不同菌株在較高復(fù)雜性相互作用網(wǎng)絡(luò)中所扮演的角色，這種實(shí)驗(yàn)方法可明確整個(gè)合成群落系統(tǒng)對(duì)特定菌株、種群或功能去除（剔除）的響應(yīng)情況。在設(shè)計(jì)合成群落實(shí)驗(yàn)中，其他需要考慮的方面有：菌株能否在液體或固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；菌株需在實(shí)驗(yàn)前生長(zhǎng)多長(zhǎng)時(shí)間、如何精確測(cè)量所有菌株的混合比例（例如光密度、細(xì)胞計(jì)數(shù)、體積）；如何將人工合成群落引入植物宿主等。

合成群落是由出于特定目的（即模擬天然微生物群落）的人工組裝而成的，與自然種群相比，人工合成群落具有較低的復(fù)雜性。簡(jiǎn)化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不能代表環(huán)境的全部廣度，但是，降低系統(tǒng)的復(fù)雜度是實(shí)驗(yàn)的先決條件，通過有針對(duì)性的操縱發(fā)現(xiàn)因果關(guān)系[57]。通過微生物合成群落直接抑制病原體已在植物上被報(bào)道，如Niu Ben等[60]組裝了一個(gè)簡(jiǎn)化但又具有代表性的合成細(xì)菌模型群落，該群落用于能夠研究玉米幼苗的群落組裝動(dòng)力學(xué)和功能。結(jié)合培養(yǎng)的方法，人工篩選的7 種根系微生物組的合成群落具有應(yīng)用潛力，該模型群落干擾了玉米幼苗病原真菌的生長(zhǎng)，從而保護(hù)了玉米幼苗。在之后的研究中

該模型可作為一種探索細(xì)菌和物種間相互作用的系統(tǒng)，研究其如何影響根微生物組的組裝并剖析對(duì)根的有益作用，將來(lái)可以在實(shí)驗(yàn)室條件下作為一個(gè)簡(jiǎn)易模型研究宿主上的微生物群。總而言之，利用合成群落作為生物防治的新型策略為建立可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展提供了機(jī)會(huì)，也為果蔬采后病害生物防治提供了新思路。

6 結(jié) 語(yǔ)

微生物是水果和蔬菜的有機(jī)組成部分，微生物群落可能與寄主果蔬、病原體和拮抗微生物之間存在相互作用，并且這種作用有助于病害控制。目前發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)（內(nèi)生和附生）的微生物群組成可能對(duì)其宿主的生理產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，它們參與了營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、病原菌拮抗和宿主對(duì)不同類型脅迫的保護(hù)[61]。微生物組技術(shù)的應(yīng)用為更深入地了解果實(shí)微生物組、為開發(fā)針對(duì)植物病原體的創(chuàng)新生物控制方法提供新的機(jī)會(huì)，也為利用微生物組開發(fā)新的果實(shí)保鮮策略提供了新的視角。但其在果蔬采后領(lǐng)域應(yīng)用中依然存在一些問題：第一，果蔬上的內(nèi)生及附生微生物數(shù)量遠(yuǎn)少于土壤及腸道菌群，而微生物組測(cè)序需要一定的微生物濃度，這使其取樣較為困難，且適用于果蔬樣品的取樣方法較少，樣品獲取仍是阻礙采后果蔬微生物組學(xué)研究的巨大挑戰(zhàn)；第二，由于果蔬多直接暴露于空氣環(huán)境中，采樣過程中影響樣品的環(huán)境因子及其他干預(yù)因素較多；第三，培養(yǎng)組學(xué)的方法在采后果蔬上應(yīng)用少且難度大；第四，不同果蔬中是否存在影響宿主-微生物組相互作用的核心微生物組尚待確定[62]，且其效力未知；第五，目前合成群落研究多集中于細(xì)菌合成群落，而果蔬上存在的細(xì)菌安全性問題有待商定；第六，果蔬宿主-微生物成員之間如何相互作用以及這些活動(dòng)和關(guān)系如何受到各種環(huán)境和農(nóng)業(yè)實(shí)踐的影響的信息仍舊缺乏[63]。最后，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)狀況會(huì)隨著發(fā)育而變化，糖和氨基酸以及其他代謝物和揮發(fā)物隨著果實(shí)的成熟而變得豐富，而這將如何影響附生和內(nèi)生微生物組，以及微生物組如何影響宿主生理和衰變敏感性尚待確定[18]。關(guān)于果蔬上微生物組研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相關(guān)過程中應(yīng)該注意的事項(xiàng)整理如圖3所示。

圖3 微生物組研究過程中各階段關(guān)鍵注意事項(xiàng)[17,64-65]Fig.3 Key considerations at each stage of the microbiome study[17,64-65]

除了注意取樣及分析過程的相關(guān)細(xì)節(jié)，還要注重新方法的及時(shí)更新和應(yīng)用，進(jìn)一步整合其他組學(xué)，包括宏蛋白組學(xué)、宏代謝組學(xué)和單細(xì)胞測(cè)序等，從而更全面、系統(tǒng)地解析采后果蔬的微生物組，且有關(guān)宿主相關(guān)微生物群組成和功能的更多認(rèn)知將為了解宿主-微生物組相互作用對(duì)果蔬代謝和抗病性的影響提供相關(guān)信息[66]。同時(shí)還應(yīng)注重微生物培養(yǎng)組學(xué)的應(yīng)用，從而更好地為合成群落的實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)。最終，在了解果蔬微生物相關(guān)信息和篩選可培養(yǎng)微生物的基礎(chǔ)上，將特定的有益微生物分類單元進(jìn)行人工“組裝”，從而達(dá)到增強(qiáng)果蔬抗病性的目的[67-68]。