凍融對牛瘤胃平滑肌膠原蛋白降解、交聯及品質的影響

曹銀娟，韓 玲,*，余群力，林 娟，李維正，鄒小紅，韓廣星，韓明山

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅祁連牧歌實業公司，甘肅 張掖 734000；3.山東綠潤食品有限公司，山東 臨沂 276000；4.內蒙古科爾沁牛業股份有限公司，內蒙古 通遼 028000）

冷凍是目前食品保藏中較為重要的貯藏方法，然而新鮮牛瘤胃在運輸、貯藏、消費過程中由于冷鏈技術不健全，溫度波動比較大，在被食用之前一直處于凍結和解凍（凍融循環）的過程[1]，因此反復凍融在商業中不可避免。然而，反復凍融對肉制品品質會造成一定的影響，如色澤劣變、組織機械損傷、蛋白質變性、解凍后水分損失增加、脂質氧化等品質劣變現象[2-3]。

目前已有相關研究證明反復凍融是影響肉品品質變化的重要因素。反復凍融會引起重結晶現象的發生，致使冰晶數量減少和體積增大，破壞細胞膜結構，損傷細胞組織結構，加速蛋白質氧化變性和汁液流失[4]。李銀等[5]研究發現牛肉中主要蛋白質的降解導致肌纖維結構破壞，使肌肉持水能力下降。Kim等[2]指出豬肉冷凍時隨著冰晶體的形成，肌細胞受到機械損傷而破裂，大量水分滲出，同時肌纖維也會發生變形和斷裂，使肌肉持水能力下降，導致解凍后肌肉大量汁液流失。有研究發現豬肉肌原纖維蛋白降解程度的增加顯著加快了肌肉汁液的流失[6]。Zhou Feibai等[7]指出豬肉中氧化反應產生的羥自由基也會引發肌纖維蛋白氧化，使其發生變性和降解。游輝煌[8]研究發現隨著凍融次數的增加，豬蹄感官品質下降，可能是由于豬蹄中含有較高的膠原蛋白。然而，平滑肌蛋白組成和結構均與骨骼肌存在差異，膠原蛋白含量較骨骼肌高10.1%[9]，而平滑肌在反復凍融過程中品質穩定性及引起品質變化的生化過程尚不清楚。

因此，本實驗以牛瘤胃為研究對象，探究了反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌品質穩定性變化及變化機理，旨在了解凍融次數對牛瘤胃平滑肌品質劣變的影響機制，以期為平滑肌肉用價值的開發、加工和品質控制提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛瘤胃購自于張掖市萬禾草畜產業科技開發有限責任公司，源于隨機選取的生長發育正常、健康無病、平均年齡3～4 歲體質量（600±30）kg的6 頭公牛。將瘤胃置于保溫箱（放冰袋）運至實驗室。

賴氨酸吡啶啉（lysine pyridinoline，LP）、羥賴氨酸吡啶啉（hydroxylysine pyridinoline，HP）、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶酶聯免疫檢測試劑盒 上海遠慕生物科技有限公司；戊二醛 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BS223S型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；H/T16MM臺式高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋 常州市億能實驗儀器廠；JJ-2組織搗碎勻漿機 江蘇國華電器有限公司；C-LM3B型數顯肌肉嫩度儀 北京天翔飛域科技有限公司；PHS-3C便攜式pH計 上海雷磁儀器廠；UV-1601酶標儀 日本島津公司；JSM-5600LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和制備

取瘤胃用蒸餾水將表面沖洗干凈，剔除筋膜及可見脂肪，用濾紙擦干表面水分并對案板、刀具及瘤胃用體積分數75%乙醇溶液消毒至完全揮發。將肉樣切成質量100 g左右的方塊，用聚乙烯食品保鮮袋包裝，樣品隨機分為6 組，每組3 份平行，在-18 ℃ 冷凍12 h、4 ℃ 解凍12 h（此為凍融1 次），分別在凍融0、1、2、3、4、5 次后測定相應的指標。

1.3.2β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶活力的測定

β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶活力均采用試劑盒進行測定，具體操作和計算參照各試劑盒的說明書。

1.3.3 HP和LP含量測定

HP、LP含量的測定參考莎麗娜[10]的方法，取樣品1 g左右于50 mL離心管中，按1∶9（m/V）加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4），10 000 r/min冰浴勻漿。然后4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液進行測定。測定步驟及計算參照試劑盒說明書進行。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

使用掃描電子顯微鏡觀察牛瘤胃平滑肌微觀結構，樣品制備方法參考常海軍[11]的方法并稍作修改。將樣品切割成2 mm×2 mm×5 mm的肉條在體積分數2.5%戊二醛溶液中于4 ℃下固定3 d，用蒸餾水徹底沖洗，樣品表面用離子濺射法涂覆金屬薄膜（10 nm），然后在掃描電子顯微鏡（20.0 kV）下放大300 倍觀察微觀結構。

1.3.5 膠原蛋白熱溶解性測定

參考常海軍[11]的方法測定。以羥脯氨酸作為標準物質制作標準曲線，標準曲線方程為y＝0.217x-0.002 5，R2=0.999 8（其中x為羥脯氨酸質量濃度/（μg/mL）；y為吸光度）。羥脯氨酸的含量乘以系數7.25換算為膠原蛋白含量，其中上清液中的蛋白含量為可溶性膠原蛋白含量；沉淀中的蛋白含量為不溶性蛋白含量。膠原蛋白溶解性通過式（1）進行計算。

1.3.6 pH值測定

參考Zuo Huixin等[12]的方法，將解凍后的樣品用便攜式pH計測定pH值，將探頭插入肉樣中，使其電極與牛瘤胃平滑肌肌肉組織充分接觸，待pH計讀數穩定后記錄數值，每個樣品測定3 次平行，結果取其平均值。

1.3.7 解凍損失率測定

在第n次冷凍之前測定樣品的質量（mn1/g），解凍之后用濾紙擦拭樣品表面去除水分，再次稱質量（mn2/g），第n次解凍損失率按式（2）計算。

1.3.8 剪切力測定

參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測定 剪切力測定法》，將熟制平滑肌沿平行于肌纖維方向切取40 mm×10 mm的肉樣，將2～3 個樣品堆疊至樣品自然高度為10 mm后采用數顯肌肉嫩度儀自帶的“V”型剪切刀架測定剪切力，重復6 次取平均值，單位以kgf表示。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，結果采用平均值±標準差表示，相關性分析采用Pearson相關系數分析法，各處理平均數間采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 凍融次數對牛瘤胃平滑肌β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶活力的影響

β-葡糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶可降解肌內膠原蛋白基質多糖（蛋白多糖）[8]，而蛋白多糖是維持結締組織機械強度的主要成分，其降解可以改善肉的嫩度[13]。由圖1A可知，隨著凍融次數的增加，β-半乳糖苷酶活力先上升后下降，在凍融4 次時達到最大（13.26 U/L），顯著高于新鮮平滑肌（6.79 U/L）（P＜0.05），可能原因是凍融處理可以弱化或破壞細胞結構；但凍融5 次時β-半乳糖苷酶活力下降至11.31 U/L，可能是凍融處理對酶本身的破壞性影響使得活力下降。由圖1B可知，隨著凍融次數的增加，β-葡糖醛酸酶活力呈波動式上升（P＜0.05），凍融5 次時β-葡糖醛酸酶活力與新鮮平滑肌相比增加了76.60%。說明牛瘤胃凍融過程肌內膠原蛋白基質多糖降解程度增加，這與Lee等[14]的研究結果一致。

圖1 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌β-半乳糖苷酶活力（A）和β-葡糖醛酸酶活力（B）的變化Fig.1 Changes in β-galactosidase activity (A) and β-glucuronidase activity (B) in bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.2 凍融次數對牛瘤胃平滑肌膠原蛋白HP和LP含量的影響

HP和LP是膠原蛋白交聯途徑中主要的穩定交聯產物，其含量越高，嫩度越差，交聯是膠原蛋白的主要性質，膠原蛋白在體內合成后會發生不同程度的交聯[15]。如圖2A所示，HP含量隨凍融次數（0～4 次）的增加呈上升趨勢（P＜0.05），凍融4 次時較新鮮平滑肌上升了384.50%，凍融5 次時略有下降（P＞0.05）。如圖2B所示，隨凍融次數的增加，LP含量基本呈“直線”趨勢增加，凍融5 次時較新鮮平滑肌增加了325.93%。表明隨凍融次數的增加，肌肉中膠原蛋白的交聯度增大，與宦海珍[16]研究發現秘魯魷魚解凍過程中肌原纖維蛋白變性導致交聯物產生的結果一致。

圖2 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌HP（A）和LP（B）含量的變化Fig.2 Changes in HP (A) and LP (B) contents in bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.3 凍融次數對牛瘤胃平滑肌微觀結構的影響

反復凍融過程中瘤胃結締組織結構變化如圖3所示，新鮮牛瘤胃平滑肌整體上肌纖維結構清晰，排列規整且緊密，肌束膜完整基本沒有破裂；凍融1 次時，牛瘤胃平滑肌肌纖維束之間有細小空隙，肌束膜和肌內膜有輕微的裂痕，說明牛瘤胃平滑肌肌束膜發生了輕微的收縮。凍融3 次時，牛瘤胃平滑肌肌纖維結構較為清晰，但肌纖維之間空隙增大，排列較松散；凍融5 次時，牛瘤胃平滑肌肌束膜及肌內膜破損斷裂程度嚴重，肌纖維束間空隙增多且變大，肌纖維排列雜亂，可以觀察到肌纖維與肌內膜明顯剖離，說明牛瘤胃平滑肌肌束膜收縮程度更為劇烈。隨著凍融次數增加，組成肌肉的各個肌束之間的縫隙明顯增多，顯示出組織結構的弱化。即隨著冷凍-解凍次數的增加，牛瘤胃平滑肌肌纖維發生明顯斷裂、結締組織膜嚴重受損，使肌肉失去原有的完整性，可能是與凍融過程中蛋白質的降解和冰晶體的機械破壞作用有關，這與李銀等[5]的研究結果一致。

圖3 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌微觀結構的變化Fig.3 Changes in microstructure of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.4 凍融次數對牛瘤胃平滑肌剪切力的影響

剪切力是肉品嫩度的直接反映，剪切力越小，肉嫩度越好[17]。由圖4可知，隨著凍融次數的增加，牛瘤胃平滑肌剪切力呈先上升再下降趨勢（P＜0.05），凍融1 次時達到最大（9.70 kgf），凍融5 次時較新鮮平滑肌下降了28.79%，其變化趨勢與Shanks等[18]對牛肉的相關品質研究基本一致。剪切力在凍融1 次時顯著上升可能是因為凍融后持水力下降導致肌肉收縮，使肌纖維排列更加緊致；而凍融1 次后剪切力下降，一方面是因為冰晶隨著凍融次數增加反復形成和消失，使細胞膜和組織結構不斷受到機械損傷而導致肌纖維結構降解和破裂，蛋白多糖降解，膠原蛋白溶解性增大，從而使牛瘤胃平滑肌肌肉質地變軟[19-20]；另一方面，反復凍融后肌肉細胞失水、平滑肌間隙增大，也會導致剪切力降低[21]。常海軍[11]研究發現牛肉中膠原蛋白交聯度的增加使膠原蛋白的纖維網狀結構更加穩定，能增加肌肉結締組織強度，使肌肉剪切力增大，這與本實驗研究結果不一致，可能是貯藏方式和肌肉種類不同所致[10-11]。

圖4 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌剪切力的變化Fig.4 Changes in shear force of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.5 凍融次數對牛瘤胃平滑肌膠原蛋白溶解性的影響

膠原蛋白溶解性是膠原蛋白的主要性質，也是影響肉品嫩度的主要因素之一[22]。由圖5可知，隨凍融次數的增加，膠原蛋白溶解性顯著增加（P＜0.05），可能是因為凍融過程中冰晶的作用使平滑肌肌束膜和肌內膜蛋白多糖降解、結締組織膜被破壞，增加了膠原蛋白溶解性，從而使剪切力下降，嫩度改善。凍融4 次時膠原蛋白溶解性較新鮮平滑肌增加了21.05%，隨凍融次數的進一步增加變化不顯著（P＞0.05）。

圖5 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌膠原蛋白溶解性的影響Fig.5 Changes in collagen solubility of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.6 凍融次數對牛瘤胃平滑肌pH值的影響

pH值是影響肉品持水性的主要因素之一[23]。李婉竹等[24]研究表明在凍融循環過程中肌肉蛋白發生降解產生的氨基酸中，當堿性自由氨基酸含量高于酸性自由氨基酸含量時，pH值就會升高，反之則減小。由圖6可知，隨著凍融次數的增加，pH值呈先上升后下降趨勢，凍融1 次時，較新鮮平滑肌上升了3.33%，可能是由于肌肉中的蛋白質分解成胺類等堿性物質。凍融5 次時pH值較新鮮平滑肌下降了3.06%，可能與反復凍融引起肌纖維及基質中蛋白變性，影響肌肉組織內酸堿平衡有關[4]。阿依木古麗等[25]研究發現隨著凍融次數的增加牛肉背最長肌的pH值顯著降低。

圖6 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌pH值的變化Fig.6 Changes in pH of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.7 凍融次數對牛瘤胃平滑肌解凍損失率的影響

肉中的細胞液隨著凍融次數的增加不斷從肌肉組織內部滲出，不僅影響其外觀，而且使肌肉中的營養成分和汁液流失增多[26]。解凍損失率是衡量肉品加工性能和營養成分損失程度的重要指標，解凍損失率越高，保水性越差[27]。從圖7可以看出，牛瘤胃平滑肌解凍損失率隨凍融次數增加顯著升高（P＜0.05），主要是因為在反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌中冰晶不斷形成和消失，使組織結構和細胞膜受到機械損害，解凍時細胞中的水分、營養成分和可溶性蛋白逐漸流失，最終導致牛瘤胃平滑肌的保水性下降[28]，這與Boonsumrej等[27]的研究結果一致。解凍損失率在前3 次凍融循環中增加了26.16%，在后2 次凍融循環中增加了64.96%，說明在凍融次數超過3 次時，保水性的下降速率加快。這可能是因為牛瘤胃平滑肌水分在冷凍過程中體積增加使肌細胞的細胞膜破裂[29]。

圖7 反復凍融過程中牛瘤胃平滑肌解凍損失率的變化Fig.7 Changes in thawing loss of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.8 牛瘤胃平滑肌品質指標與膠原蛋白降解、交聯指標間相關性分析

由表1可知，在凍融循環過程中，剪切力與β-半乳糖苷酶活力、β-葡糖醛酸酶活力、HP含量、LP含量和膠原蛋白溶解性呈極顯著負相關性（P＜0.01）。結合前面這些指標測定結果，可以說明隨著凍融次數的增加，肌內膠原蛋白基質多糖顯著降解、溶解性增大，結締組織弱化加劇，導致剪切力下降。Nishimura等研究表明牛肉肌束膜中的蛋白多糖顯著降解，加快了牛肉結締組織弱化，顯著改善了牛肉的嫩度[30]，與本實驗結果一致。然而，有研究表明膠原蛋白交聯可提高剪切力，而本實驗結果得出膠原蛋白交聯物HP和LP含量與剪切力呈極顯著負相關（P＜0.01），因此，牛瘤胃平滑肌嫩度改善主要取決于冰晶對肌肉的破壞和蛋白降解的作用，而蛋白交聯對其影響較小。解凍損失率與pH值呈顯著負相關（P＜0.05），與HP含量、LP含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；Liu Zelong等[31]研究發現蛋白質發生交聯與肉的保水性呈顯著負相關（P＜0.05），Melody等認為pH值降低是肉保水性下降的主要原因[32]，與本實驗研究結果一致。

表1 牛瘤胃平滑肌各指標間的Pearson相關系數Table 1 Pearson correlation coefficients among various indicators

3 結 論

隨著凍融次數的增加，牛瘤胃平滑肌膠原蛋白降解程度（β-半乳糖苷酶活力、β-葡糖醛酸酶活力）增大，結締組織破壞嚴重，膠原蛋白溶解性增大，膠原蛋白交聯度增大，解凍損失率增大，使牛瘤胃平滑肌保水性下降。凍融超過1 次后，剪切力下降，說明平滑肌嫩度逐漸得到改善。然而，在凍融3 次后，剪切力下降速率變慢，解凍損失率升高速率加快。因此，從食用品質和商業價值綜合考慮，凍融次數應控制在3 次以內。