姜黃素介導的光動力技術對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺滅效果

檀利軍，胡鈺梅，陳博文，陳 璐，胡 趙，王敬敬,3,*，劉海泉,4,5，趙 勇,4,5,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.南昌大學生命科學學院，江西 南昌 330031；3.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528225；4.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；5.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽型革蘭氏陰性致病菌，廣泛存在于各類海產品中[1]。這種細菌被認為是食用生的或未煮熟的海產品引起人類急性腸胃炎或腹瀉的主要原因[2]。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是嗜冷型革蘭氏陰性腐敗菌，是海產品等高蛋白食品中常見的優勢腐敗菌[3]。近年來由于副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的污染導致了嚴重的公共衛生問題和巨大的經濟損失[4-5]，因此，對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的研究日益引起社會關注，開發抑制或殺滅這些有害菌的策略顯得尤為重要。

為了控制食品加工環境中有害微生物的污染，近年來研究出很多的新型抗菌策略（如酶制劑、紫外線滅菌、高壓脈沖電場等）[6]。這些技術方法雖然與傳統的抗菌策略（如消毒劑、抗生素等）相比更加綠色環保，但自身也存在很多缺點，包括成本高、可能改變食品原有品質、殺菌效果不穩定以及存在一定的安全問題等[7]。因此，有必要開發新型抗菌技術和有效的根除方法來控制有害微生物的污染。光動力技術（photodynamic technology，PDT）又稱光輻射療法，是一種在臨床醫學中廣泛采用的殺滅致病微生物的新方法[8-9]。這種新型的非熱殺菌技術在光敏劑和有氧的條件下通過適當波長的光照射后即可產生活性氧物質（reactive oxygen species，ROS）。ROS能夠破壞細胞和微生物的大分子結構進而導致其受損或死亡[10]。然而該技術在食品工業中對有害微生物方面的應用卻鮮有報道。

姜黃素是目前世界上使用最為廣泛的天然色素之一，其原料來源廣、成本低，且無毒無污染[11]。已有研究發現，姜黃素在藍光下（波長范圍420～480 nm）具有光敏活性，對單核細胞增生李斯特菌[12]、假單胞菌[13]、金黃色葡萄球菌[14]等具有很強的殺滅效果。然而，姜黃素介導的PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的抗菌作用及其機制尚未明確，此外，對其生物被膜的清除效果鮮見報道。因此，本研究將系統地探究姜黃素介導的PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌及其生物被膜的抗菌效果，以期為食品工業設計新型高效的非熱光動力殺菌技術提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

副溶血性弧菌ATCC 17802來源于中國科學院微生物研究所；副溶血性弧菌E36、腐敗希瓦氏菌E05、E08均由本實驗室從對蝦中分離獲得。

姜黃素（食品級，純度高于99%） 上海生工生物工程股份有限公司；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptone soy broth，TSB）、鐵瓊脂培養基 北京陸橋技術股份有限公司；ROS活性氧熒光探針（2’,7’-二氯二氫熒光素-雙乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）） 北京索萊寶生物技術有限公司；9,10-蒽二基-雙（亞甲基）二甲酸（9,10-anthracenediylbis（methylene） dimalonic acid，ABDA） 美國Sigma公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化銨（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）（5 mg/mL）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、體積分數4%多聚甲醛/體積分數2.5%戊二醛掃描電子顯微鏡固定液、SYBR Green I核酸染料 上海生工生物工程股份有限公司；其他化學分析試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LED藍光光源（波長455～460 nm，燈管長度30 cm，每秒輻照劑量3.80 mJ/cm2） 飛利浦照明電子（上海）有限公司；Bioscreen C MBR-全自動微生物生長曲線分析儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；5417R全自動臺式離心機 德國Eppendorf公司；TCS SP8激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國徠卡公司；SNE-4500M場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本電子株式會社；SynergyHTX多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；PTR-60分子雜交儀 英國Grant儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

將兩株副溶血性弧菌（-80 ℃下保藏在體積分數50%的甘油管中）分別劃線于TCBS平板上，37 ℃下培養12 h后挑取綠色單菌落接種至TSB培養基（含3%（質量分數）NaCl）中，置于恒溫（37 ℃）培養箱中過夜培養（200 r/min），隨后將兩株菌的菌液混合，在4 000 r/min的轉速下離心10 min；將兩株腐敗希瓦氏菌（-80 ℃下保藏在體積分數50%的甘油管中）分別劃線接種于鐵瓊脂平板上，25 ℃下培養24 h后挑取黑色單菌落到TSB培養基中，置于恒溫（30 ℃）培養箱中過夜培養（200 r/min），隨后將兩株菌的菌液混合并用相同條件離心10 min。用質量分數0.85% NaCl溶液分別將上述離心菌體稀釋至濃度約為8（lg（CFU/mL））后備用。

1.3.2 光敏劑的配制

稱取0.036 84 g姜黃素粉末溶解于100 mL的無水乙醇中，混勻后即可得到濃度為1 000 μmol/L的姜黃素儲備液，置于4 ℃避光保存。

1.3.3 PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的滅活

將100 μL菌液和不同濃度的姜黃素（副溶血性弧菌對應姜黃素濃度：0.5、0.7、1.0、2.0、3.0 μmol/L；腐敗希瓦氏菌對應姜黃素濃度：1、3、5、7、10 μmol/L。光照時間均為8 min）以及質量分數0.85% NaCl溶液加入到離心管中使體系總體積為1 mL。在分子雜交儀中100 r/min孵育20 min后加入24 孔板中光照不同的時間（副溶血性弧菌對應光照時間：2、5、8、10、20 min，姜黃素濃度為1 μmol/L；腐敗希瓦氏菌對應光照時間：2、5、8、10、15 min，姜黃素濃度為5 μmol/L）。選擇未經光照和姜黃素處理（L-C-）的樣品作為陰性對照組，僅光照（L+C-）或僅姜黃素（L-C+）處理的樣品作為空白對照組。PDT處理結束后，將副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌液梯度稀釋后分別涂布于TCBS平板（12 h、37 ℃）和鐵瓊脂平板（24 h、25 ℃），培養到指定時間后計數[12]。

1.3.4 ROS和單線態氧的監測

將100 μL菌液加入0.9 mL PBS中使細菌懸浮，加入不同濃度的姜黃素（副溶血性弧菌對應姜黃素濃度：0.5、0.7、1.0 μmol/L；腐敗希瓦氏菌對應姜黃素濃度：1、3、5 μmol/L）混合后再分別加入10 μmol/L DCFHDA試劑（監測ROS的產生情況）或100 μmol/L ABDA試劑（監測單線態氧的產生情況）。孵育結束后，光照不同時間（副溶血性弧菌對應光照時間：8、10、20 min；腐敗希瓦氏菌對應光照時間：8、10、15 min），分別用多功能酶標儀測其發射波長529 nm處最大熒光發射強度（ROS產生情況）與399 nm波長處的光密度值（單線態氧產生情況）。以未經光照和姜黃素處理為陰性對照組（L-C-）。最終單線態氧產生量以OD399nm（陰性對照組）-OD399nm（實驗組）+OD399nm（姜黃素）表示[15]。

1.3.5 細菌再生長能力的評估

將副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌液分別和不同濃度的姜黃素在體系中混合均勻，按1.3.3節條件孵育后光照不同的時間。具體處理條件的組合為副溶血性弧菌：0.5 μmol/L+8 min、1.0 μmol/L+8 min、1.0 μmol/L+20 min；腐敗希瓦氏菌：1 μmol/L+8 min、5 μmol/L+8 min、5 μmol/L+15 min。未經光照和姜黃素處理為陰性對照組（L-C-）。隨后取每組樣品20 μL和180 μL無菌新鮮TSB（副溶血性弧菌組需要額外添加質量分數3% NaCl）加入到100 微孔板中。生長曲線分析儀設置參數為培養溫度25 ℃；每隔2 h讀取OD600nm一次；總運行時長為48 h，測定PDT處理后副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的生長曲線[16]。

1.3.6 SEM觀察細菌表面形態變化

不同條件的PDT處理結束后，收集菌液到離心管中10 000 r/min離心5 min。棄除上清液后加入1 mL SEM固定液，4 ℃下靜置過夜。用體積分數30%、50%、70%、80%、90%、100%和100%的乙醇依次脫水。將樣品滴加在無菌玻璃片上，干燥后進行鍍金處理，每個樣品隨機挑選3 個不同視野在SEM（5.0 kV、5 000 倍）下進行觀察[17]。

1.3.7 結晶紫法定量生物被膜生物量

將10 μL副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌分別與990 μL的無菌新鮮TSB培養基（副溶血性弧菌額外添加3%（質量分數）NaCl）加入到24 孔板中，隨后將孔板放入25 ℃培養箱中靜置培養6、12、18、24、36、48 h。培養結束后移除浮游菌，并用PBS清洗3 次，放入55 ℃烘箱干燥后每孔加入1 mL體積分數0.1%結晶紫溶液室溫靜置30 min。用PBS清洗3 次以除去多余的結晶紫，每孔加入1 mL體積分數95%乙醇溶液，室溫下靜置30 min后測其在600 nm波長處的光密度值[18]，以OD600nm表示生物被膜總生物量。

副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌生物被膜分別培養24 h和18 h后，取出24 孔板并用PBS清洗3 次移除浮游菌。加入不同濃度的姜黃素并光照不同的時間（具體處理條件組合見2.3節圖5）。處理結束后，用PBS清洗并放入烘箱干燥，每孔加入1 mL結晶紫溶液后室溫靜置30 min。用PBS去除多余的結晶紫后，每孔加入1 mL體積分數95%乙醇溶液，室溫下靜置30 min后測其在600 nm波長處的光密度值[18]，以OD600nm表示生物被膜總生物量。

1.3.8 MTT法檢測生物被膜細胞活力

副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜經過PDT處理后，每孔加入1 mL新鮮TSB培養基（副溶血性弧菌額外添加3%（質量分數）NaCl）和100 μL MTT試劑，置于25 ℃培養箱中靜置孵育2 h以上。用PBS清洗以移除浮游菌后每孔加入1 mL二甲基亞砜，室溫靜置30 min后檢測在570 nm波長處的光密度值[19]，以OD570nm表示細胞活力。

1.3.9 CLSM觀測生物被膜結構變化

副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜經過PDT處理后，每孔加入1 mL SEM固定液，4 ℃下固定30 min，用PBS洗3 次以去除多余的固定液。隨后每孔加入200 μL核酸染料，室溫避光染色30 min。用PBS洗3 次以去除多余的染料，干燥后置于CLSM（200 倍）下隨機挑選3 個不同的視野觀察并拍照。通過ISA-2生物被膜結構參數分析軟件分析導出圖像的生物體積、孔隙度、同質性、質構熵以及粗糙度[20]。

1.4 數據處理與分析

每組樣品設置3 個平行，并進行3 次獨立重復實驗后取平均值。通過Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理；通過SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異；通過Graphpad Prism 8.4.3和Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 PDT分別對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺菌效果

姜黃素濃度對PDT處理副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的影響分別如圖1A、B所示。副溶血性弧菌陰性對照組（L-C-）菌落總數為7.51（lg（CFU/mL）），僅光照（8 min）或僅加姜黃素（3.0 μmol/L）處理時，菌落總數并無顯著變化（圖1A）。保持光照時間為8 min，當姜黃素濃度為0.5 μmol/L時，菌落總數顯著下降至6.22（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。當姜黃素濃度提高到1.0 μmol/L時，菌落總數進一步下降至4.22（lg（CFU/mL））。此外，添加濃度為3.0 μmol/L的姜黃素并光照8 min時，在平板上不能檢測到任何菌落。同樣，PDT對腐敗希瓦氏菌有類似的殺滅作用（圖1B），腐敗希瓦氏菌所有對照組之間的菌落總數也沒有顯著差異；當姜黃素濃度增加到5 μmol/L時，菌落總數下降至3.60（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；進一步提升姜黃素濃度到10 μmol/L時，在平板上無法檢測到菌落。

光照時間對PDT處理副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的影響分別如圖1C、D所示。與陰性對照組相比，僅光照或者僅加姜黃素處理，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌落總數均無顯著減少。當加入1 μmol/L姜黃素并光照2 min后，副溶血性弧菌的菌落總數下降至6.23（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；繼續延長光照時間至8 min后，菌落總數下降至4.03（lg（CFU/mL））；當光照時間達到20 min時，在平板上沒有檢測到菌落（圖1C）。在處理腐敗希瓦氏菌中也發現類似的失活趨勢。當姜黃素的濃度為5 μmol/L、光照時間為8 min時，菌落總數顯著降低至3.34（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；當光照時間延長至15 min時，在平板上已經不可檢測到菌落（圖1D）。綜上，PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺菌效果均表現出強烈的光敏劑濃度和光照時間的依賴性。

圖1 姜黃素介導的PDT在不同處理條件下對副溶血性弧菌（A、C）與腐敗希瓦氏菌（B、D）的殺菌效果Fig.1 Inactivation effects of curcumin-mediated PDT on V.parahaemolyticus (A, C) and S.putrefaciens (B, D) under different treatment conditions

為了進一步驗證PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的抗菌效果，對經過PDT處理后副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的再生能力進行了評估，結果如圖2所示。在陰性對照組（L-C-）中，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌兩者都在經歷短暫的遲緩期（2 h）后迅速進入對數期并很快達到穩定期。然而，隨著姜黃素濃度的增加和光照時間的延長，副溶血性弧菌的遲緩期明顯延長。當姜黃素濃度為0.5 μmol/L、光照時間為8 min時，副溶血性弧菌經歷了4 h的遲緩期才開始進入對數期。當姜黃素濃度為1 μmol/L、光照時間為20 min時，副溶血性弧菌的遲緩期達到了8 h；且到達穩定期后的最大OD值（OD600nm≈0.4）只有陰性對照組（OD600nm≈0.8）的一半。此外，腐敗希瓦氏菌也得到了類似的結果。值得注意的是，當姜黃素濃度為5 μmol/L、光照時間為15 min時，腐敗希瓦氏菌被徹底殺滅并停止生長（圖2B）。這進一步證實了PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌良好的滅活效果。

圖2 姜黃素介導的PDT處理對副溶血性弧菌（A）與腐敗希瓦氏菌（B）再生能力的影響Fig.2 Regrowth evaluation of V.parahaemolyticus (A) and S.putrefaciens (B) treated by curcumin-mediated PDT

為了更加深入探究PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的作用機理，通過SEM對細菌的外部形態進行了觀察。陰性對照組（L-C-）中的副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌形態飽滿、輪廓清晰（圖3A1、B1）。經PDT處理后（副溶血性弧菌：0.5 μmol/L+8 min；腐敗希瓦氏菌：1 μmol/L+8 min），部分細菌開始發生形變，細胞壁破損，細菌細胞結構開始出現坍塌（圖3A2、B2）。進一步提高PDT的處理強度后（副溶血性弧菌：1 μmol/L+20 min；腐敗希瓦氏菌：5 μmol/L+15 min），幾乎所有的細菌表面都發生了嚴重的形變，由于細菌細胞內容物流失嚴重導致整個細菌趨向于扁平態（圖3A3、B3）。綜上，姜黃素介導的PDT殺滅副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的根本原因是其能夠使細菌細胞壁破損進而導致細菌裂解死亡。

圖3 姜黃素介導的PDT處理對副溶血性弧菌（A）與腐敗希瓦氏菌（B）細菌形態的影響Fig.3 Effect of curcumin-mediated PDT on cell morphology of V.parahaemolyticus (A) and S.putrefaciens (B)

Deng Xin等[21]研究了亞甲基藍介導的PDT對副溶血性弧菌的抗菌效果，結果發現，亞甲基藍在激光照射下，副溶血性弧菌菌落總數最大能降低約5（lg（CFU/mL））。最近，Gong Chen等[13]研究了姜黃素介導的PDT對鱘魚特定腐敗菌（假單胞菌）的殺菌效果，結果發現，在姜黃素30 μmol/L、LED燈功率15 W、照射時間90 s的條件下達到了最強的殺菌效果，假單胞菌的菌落總數大約降低了3（lg（CFU/mL））。本研究發現姜黃素介導的PDT在LED藍光光源下對副溶血性弧菌（致病菌）與腐敗希瓦氏菌（腐敗菌）都有著更加顯著的殺菌效果（姜黃素濃度分別為3.0 μmol/L與10 μmol/L、光照時間為8 min時，能降低副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌落總數7（lg（CFU/mL））以上），并且這是本課題組首次應用PDT殺滅腐敗希瓦氏菌。另外本研究還發現，腐敗希瓦氏菌比副溶血性弧菌對姜黃素介導的PDT敏感性更低，這可能與菌株的異質性有關[22]。更重要的是，與有毒的亞甲基藍相比，姜黃素是一種從植物中分離出來的綠色、無毒的天然活性成分，具有多種藥用價值，在許多國家被用作食品添加劑[14]。此外，本研究還發現PDT是最終通過破壞細菌細胞表面結構（細胞壁）以達到殺滅副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的效果，主要原因是副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌兩者均為革蘭氏陰性菌，它們的細胞壁由相對不透水的外膜組成，外膜中含有豐富的脂多糖（疏水性），內膜含有磷脂（疏水性）[23]，而姜黃素作為一種脂溶性化合物更容易吸附在細胞壁上進而發揮功效[24]。另外，PDT的殺菌效率還與光敏劑的吸收光譜有關[24]。本研究挑選的藍色LED光源的光譜范圍（455～460 nm）正是姜黃素的最大吸收范圍，從而讓姜黃素發揮出了最大的抗菌功效。因此，姜黃素介導的藍色LED光動力技術能夠破壞副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的細胞結構，進而導致其死亡?？傊S素介導的PDT有望成為食品工業中有效清除致病菌與腐敗菌的一種新途徑。

2.2 PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺菌機制

當特定波長的光照射到微生物表面上時，一部分會被光敏劑吸收，光敏劑被激發到更高的能量狀態，在其返回基態的過程中，與鄰近的細胞質分子發生碰撞，導致能量轉移，隨后產生高能量、高反應性分子ROS[24]。ROS通過氧化微生物細胞內的脂質、蛋白質和核酸導致細胞調亡。這些ROS包括單線態氧、羥自由基、超氧陰離子自由基和過氧化氫[24]。在產生的ROS中，單線態氧是最具破壞性的。為了進一步探究PDT滅活副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌過程中所涉及的作用機制，本研究采用DCFH-DA法與ABDA試劑法監測了PDT過程中ROS和單線態氧的產生水平，結果如圖4所示。在陰性對照組（L-C-）中均檢測到了微弱的ROS熒光信號（DCF熒光發射強度與ROS的產生量成正比）（圖4A1、B1），這是由于細菌代謝過程中產生內源ROS的影響。提高姜黃素的濃度（副溶血性弧菌：0.5、0.7、1.0 μmol/L；腐敗希瓦氏菌：1、3、5 μmol/L）與延長光照時間（副溶血性弧菌：8、10、20 min；腐敗希瓦氏菌：8、10、15 min）時，體系中ROS的水平均顯著提升（P＜0.05）。單線態氧的產生水平也具有類似的變化趨勢。值得注意的是，當保持光敏劑濃度不變，延長光照時間時，單線態氧的水平不再顯著增加（圖4A2、B2）。出現這種現象的原因可能是隨著時間的延長，由于單線態氧不穩定，容易分解或者轉換為氧氣[10,25]。這些結果間接表明光敏劑濃度與光照時間影響PDT殺菌效率的根本原因是ROS與單線態氧產生水平上的差異。因此，可以推測出姜黃素介導的PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的抗菌機制，即在PDT處理過程中，姜黃素分子吸附在疏水性的細胞壁上，在藍光的照射下產生了大量的ROS，具有強氧化作用的ROS導致細菌發生損傷，隨后細胞壁疏松出現破洞，細菌隨之裂解死亡。

圖4 姜黃素介導的PDT在不同處理條件下副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌ROS和單線態氧的產生Fig.4 Production of ROS and singlet oxygen species in V.parahaemolyticus and S.putrefaciens treated by curcumin-mediated PDT under differentt conditions

2.3 PDT分別對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除效果

利用結晶紫染色法監測了副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜總生物量隨著時間變化的動態形成過程（圖5A）。結果表明，副溶血性弧菌（OD600nm＝1.81±0.15）與腐敗希瓦氏菌（OD600nm＝1.99±0.17）生物被膜分別在24 h和18 h后到達成熟期。因此，本研究分別選取該時刻形成的生物被膜來進行后續的PDT實驗。

不同濃度姜黃素和不同光照時間對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的總生物量的影響分別如圖5B、C所示。與陰性對照組（L-C-）相比，單獨光照（L+C-）或姜黃素（L-C+）處理均不會引起生物被膜的顯著變化。當姜黃素濃度為10 μmol/L、光照時間為30 min時，副溶血性弧菌生物被膜總生物量降低了17%；進一步提高姜黃素的濃度到30 μmol/L時，總生物量降低了50%；此外，當姜黃素的濃度為30 μmol/L、光照時間延長至60 min時，生物被膜總生物量下降了70%。PDT處理腐敗希瓦氏菌生物被膜也得到了類似的結果，最大清除率約為62%。同時，本研究檢測了在PDT處理過程中副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜細胞活力的變化。如圖5D、E所示，僅光照（L+C-）或姜黃素（L-C+）處理組與陰性對照組（L-C-）相比生物被膜細胞活力并無顯著性變化。當姜黃素濃度為10 μmol/L、光照時間為30 min時，副溶血性弧菌生物被膜的細胞活力（OD570nm）出現大幅下降（P＜0.05），由對照組的0.523降低至0.285；進一步提高姜黃素的濃度到30 μmol/L，細胞活力下降至0.07；當采用姜黃素濃度為30 μmol/L、光照時間為60 min的組合條件處理時，OD570nm趨近于零。腐敗希瓦氏菌生物被膜細胞活力的變化趨勢與副溶血性弧菌類似。Araújo等[26]通過熒光光譜法評估了姜黃素介導的藍色LED光動力技術對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌功效，結果表明，經過PDT處理后，與對照組相比，菌落總數降低了3.6（lg（CFU/mL））；此外，通過熒光光譜圖像發現生物被膜數量也明顯減少。Quishida等[27]評估了姜黃素介導的PDT對不同生長階段的念珠菌與鏈球菌生物被膜的潛在作用。通過結晶紫法和XTT法表征了PDT處理前后念珠菌與鏈球菌生物被膜的總生物量和細胞活力的變化。結果也同樣發現，與對照組相比，PDT處理組的總生物量與細胞活力均出現顯著性降低（P＜0.05）。這些研究發現進一步證明了姜黃素介導PDT處理不但具有高效的殺菌效果，而且還有良好的抗生物被膜特性。

圖5 副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜隨時間的動態形成過程（A）及姜黃素介導的PDT處理對副溶血性弧菌（B、D）與腐敗希瓦氏菌（C、E）生物被膜的清除與細胞活力的影響Fig.5 Biofilm formation by V.parahaemolyticus and S.putrefaciens as a function of time (A) and effect of curcumin-mediated PDT on biofilm biomass and cell viability of V.parahaemolyticus (B, D) and S.putrefaciens (C, E)

在此基礎上，進一步通過CLSM表征了姜黃素介導的PDT對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除效果，結果如圖6所示。陰性對照組的副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌都呈現出緊湊且密集分布的生物結構（圖6A1、B1）。然而，當姜黃素濃度分別為10 μmol/L和20 μmol/L、光照時間為30 min時，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌都呈現出稀疏和不均勻的分散結構（圖6A2、B2）。當姜黃素的濃度分別提高到30 μmol/L和50 μmol/L、光照時間為60 min時，與對照組相比，兩種細菌的生物被膜都變得極其稀疏、松散（圖6A3、A4、B3、B4）。

圖6 姜黃素介導的PDT在不同處理條件下副溶血性弧菌（A）與腐敗希瓦氏菌（B）的CLSM圖像Fig.6 Confocal laser scanning microscope images of V.parahaemolyticus (A)and S.putrefaciens (B) after curcumin-mediated PDT treatment under different conditions

生物被膜的定量圖像分析結果顯示，在經過姜黃素濃度為30 μmol/L（腐敗希瓦氏菌為50 μmol/L），經光照60 min處理后（以下分析均為該條件），副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的生物體積分別顯著下降至3.2×104μm3和9.0×104μm3（表1），與對照組相比分別大約下降了93%與85%?？紫抖确从沉松锉荒ぶg的致密程度，孔隙度越小，代表生物被膜越致密[28-29]。如表1所示，經過PDT處理后，副溶血性弧菌生物被膜的孔隙度從0.79上升到0.98（P＜0.05），腐敗希瓦氏菌生物被膜的孔隙度從0.74上升到0.98（P＜0.05）。同質性通常用于衡量細胞簇的相似性，同質性越高，表明簇結構越均勻。一般來說，同質性的大小隨著細胞簇數量的減少而增加[28-29]。經過PDT處理的副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的同質性均大幅增加（P＜0.05）。因此可以得出結論，姜黃素介導的PDT能有效根除生物被膜中副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的細胞。同時，作為生物被膜圖像尺度隨機性度量的質構熵的分析結果也印證了表1中同質性的結果。PDT處理后副溶血性弧菌的質構熵由3.50降低至1.73（P＜0.05），腐敗希瓦氏菌的質構熵由3.53降低至1.74（P＜0.05）。質構熵越高，生物膜圖像的異質性就越大[28]。這意味著質構熵的降低將有助于異質性的降低。粗糙度提供了生物被膜厚度變化的度量，是反映生物被膜表面異質性的指標[30]。在本研究中，隨著姜黃素濃度的增加和光照時間的延長，生物被膜粗糙度顯著增加（P＜0.05），這與同質性的變化趨勢一致。可以推斷，生物被膜粗糙度的增加將極大地促進姜黃素附著在生物被膜表面，這可能有助于增強PDT的殺菌能力。綜上，姜黃素介導的藍色LED光動力技術對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除具有同樣的高效性。

表1 姜黃素介導的PDT在不同處理條件下副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜結構參數的變化Table 1 Changes in biofilm structure parameters of V.parahaemolyticus and S.putrefaciens after curcumin-mediated PDT treatments

3 結 論

本研究表明，姜黃素介導的PDT能有效殺滅副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌并清除其成熟的生物被膜。PDT殺菌過程中ROS和單線態氧的產生水平與SEM的結果表明，姜黃素介導的PDT殺菌機制是通過產生大量具有強氧化作用的ROS作用于細菌，并最終導致細菌細胞壁破損進而裂解死亡。此外，本研究還進一步探究了姜黃素介導的PDT的抗生物被膜效果。在宏觀層面上通過結晶紫法定量生物被膜，通過MTT法檢測細胞活力；在微觀層面上通過CLSM觀察生物被膜并對其圖像的結構參數進行分析，包括生物體積、孔隙率、同質性、質構熵和粗糙度。結果表明，姜黃素介導的PDT對生物被膜同樣具有良好的清除效果。綜上，姜黃素介導的PDT可有效地控制有害微生物及其生物被膜的形成，從而大大降低食品安全風險。