超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定知母藥材中8種植物生長調節劑的殘留量*

黃曉婧，曾楨，肖春霞，許莉，李慶，趙小勤

(成都市藥品檢驗研究院/中藥材質量監測評價重點實驗室，成都 610045)

中醫藥具有幾千年的悠久歷史，是中華民族的寶貴財富[1]。人口的增加及中醫藥的發展導致對中藥材的需求量不斷增加，野生資源的過度開發也造成了中藥資源的嚴重短缺。中藥栽培作為一個新興的產業應運而生，并逐漸走向了規?；痆2]。植物生長調節劑為人工合成的對植物生長發育有調節作用的化學物質，能有效調節植物的生長發育過程，達到穩產增產、改善品質、增強植物抗逆性等目的[3]。植物生長調節劑在農林果蔬園藝等領域已廣泛使用，其可以顯著縮短生長年限并增加產量，在藥用植物種植中的應用研究始于20世紀80年代末[4]，集中于根及根莖類藥材，如應用在丹參[5]、川白芷[6]、麥冬[7]等品種上，以提高產量。但在增產的同時也具有一定的毒性，如赤霉素可能增加皮膚和膀胱慢性炎癥的發生[8]，多效唑原藥在一定劑量時可導致繁殖毒性[9]。也有研究表明，植物生長調節劑會使黨參有效成分黨參炔苷含量降低[10]。

知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)干燥根莖，主要化學成分包括甾體皂苷、木質素、黃酮等[11]，具有抗腫瘤、抗炎、改善老年癡呆、改善骨質疏松等作用[12]。目前，對知母的研究主要集中在有效成分及藥理方面，筆者未見檢測知母中植物生長調節劑的報道。本研究針對根莖類常用的8種植物生長調節劑，采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術建立其在知母中的含量檢測方法，以期為知母生產過程中質量控制和安全性檢測提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜串聯6470三重四級桿質譜聯用儀(UPLC-MS/MS，美國安捷倫公司)；AUX220型電子天平(日本島津公司，感量：0.001 mg)；XPE26型電子天平(梅特勒-托尼多儀器有限公司，感量：0.001 mg)；SK250H型超聲波清洗器(250 W，53 kHz，上?？茖С晝x器有限公司)。

1.2藥品與試劑 丁酰肼(批號：20927，含量：97.0%)、矮壯素(批號：111686，含量：99.0%)、助壯素(批號：112950，含量：99.0%)、4-硝基苯酚鈉(批號：30320，含量：92.9%)、氯吡脲(批號：109007，含量：99.2%)對照品均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，赤霉素(批號：20170324，含量：99.2%)、多效唑(批號：20170616，含量：99.4%)、烯效唑(批號：20160311，含量：99.8%)對照品均購于上海市農藥研究所有限公司。

試劑：乙腈(德國Merck公司，色譜純)；甲酸銨(美國Fisher公司，質譜級)；水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

30批次知母樣品(編號s1～s30)，經成都市食品藥品檢驗研究院周世玉主任中藥師鑒定，為百合科知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，樣品信息見表1。

表1 知母樣品信息

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 分別精密稱取丁酰肼、矮壯素、助壯素、赤霉素、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、多效唑、烯效唑對照品各約10 mg，置于10 mL量瓶，加乙腈溶解定容，制成約1 mg·mL-1單標儲備液，儲存于-20 ℃冰箱。再用乙腈稀釋配制成1 μg·mL-1混合對照品溶液，于棕色量瓶保存(12 h內使用)。

2.1.2供試品溶液 精密稱取知母樣品粉末(過三號篩，篩孔內徑355 μm)3 g，置50 mL具塞離心管，加入含0.1%甲酸的乙腈提取液20 mL，渦旋混勻30 s，超聲處理20 min，4000 r·min-1離心10 min(r=60 mm)，靜置，取上清液。加乙腈10 mL，同法提取1次，合并上清液。于40 ℃氮氣吹至1～2 mL，加50%乙腈定容至10 mL，用孔徑0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.1.3空白對照 在不加樣品的情況下，同“2.1.2”項操作，得空白對照溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSST3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：5 mmol·L-1甲酸銨溶液(流動相A)-乙腈(流動相B)，梯度洗脫，0～2 min，98%A；2～3 min，98%A→65%A；3～6 min，65%A→60%A；6～10 min，60%A→15%A；10～11 min，15%A→10%A；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。

2.3質譜條件 離子源：電噴霧(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：正、負離子同時掃描；檢測方式：多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)，毛細管電壓：4000 V(正離子模式)；3500 V(負離子模式)；氣體溫度：350 ℃；氣體流速：10 L·min-1；8種植物生長調節劑質譜分析條件見表2，倍增管電壓(electron multiplier voltage ，EMV)分段條件見表3。 在上述色譜條件下，對照品溶液、樣品溶液和空白對照溶液總離子流圖見圖1～3。MRM離子流圖見圖4。

表2 8種植物生長調節劑質譜分析參數

表3 質譜分段電壓

1.丁酰肼；2.矮壯素；3.助壯素；4.赤霉素；5.4-硝基苯酚鈉；6.氯吡脲；7.多效唑；8.烯效唑。

圖2 知母樣品總離子流圖

圖3 空白對照總離子流圖

2.4線性關系考察 取未檢出8種植物生長調節劑的知母樣品，同“2.1.2”項下操作，制成空白基質提取液。采用空白基質提取液，將“2.1.1”項混合對照溶液稀釋成濃度分別為1000，500，100，50，10，1，0.5，0.1，0.02 ng·mL-1溶液，按“2.2”“2.3”項實驗條件分析，以濃度為橫坐標、定量離子對峰面積為縱坐標，進行線性回歸。結果見表4。

圖4 8種植物生長調節劑多反應監測離子流圖

表4 8種植物生長調節劑線性范圍、檢出限和定量限測定結果

2.5定量限與檢測限考察 精密量取“2.1.1”項混合對照品溶液，以乙腈倍比稀釋，再按“2.2”“2.3”項條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為 3：1，10：1時分別得檢測限、定量限。結果見表4。

2.6精密度實驗 取“2.4”項50 ng·mL-1混合對照品溶液，按“2.2”“2.3”項實驗條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果丁酰肼、矮壯素、助壯素、赤霉素、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、多效唑、烯效唑峰面積RSD分別為1.74%，2.73%，2.73%，2.39%，1.49%，3.13%，2.05%，2.56%(n=6)。表明該儀器精密度良好。

2.7穩定性實驗 精密吸取“2.6”項混合對照品溶液，于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h，按“2.2”“2.3”項實驗條件進行分析，測定峰面積。結果丁酰肼、矮壯素、助壯素、赤霉素、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、多效唑、烯效唑峰面積RSD分別為1.35%，1.88%，2.12%，1.89%，1.33%，2.06%，2.15%，2.11%(n=6)。表明對照品溶液在12 h內穩定。

2.8加樣回收率實驗 精密稱取未檢測出植物生長調節劑的知母樣品1.5 g，共6份，分別加入混合對照品溶液1 mL(濃度10 ng·mL-1)，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”“2.3”項實驗條件進行分析，記錄峰面并計算加樣回收率，結果見表5。

表5 8種植物生長調節劑加樣回收率實驗結果

續表5 8種植物生長調節劑加樣回收率實驗結果

2.9含量測定結果 取30批次知母樣品，按照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備，按照“2.2”“2.3”項方法進樣，結果s2批次矮壯素含量為6.3 μg·kg-1，s26批次矮壯素含量為3.8 μg·kg-1。其余批次均未檢出。

3 討論

3.1色譜條件優化 本研究考察了不同色譜柱對多成分的分離效果和峰形影響。對比了Agilent Eclipse plus C18RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，8種待測組分性質差異較大，矮壯素、助壯素、丁酰肼極性較大，T3作為一種親水性色譜柱，對這3種成分的分離效果更好，但4-硝基苯酚鈉峰形較差。綜合考慮8種成分的分離效果及峰形，最終選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。

液相色譜-質譜聯用儀中，流動相通常使用乙腈作為有機相[13]，為增加離子化效率通常在水相中添加一定濃度甲酸、甲酸銨或乙酸銨等。筆者在本實驗考察了0.1%甲酸、5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸、5 mmol·L-1甲酸銨溶液和5 mmol·L-1乙酸銨溶液。結果5 mmol·L-1甲酸銨溶液比加入了甲酸的流動相對赤霉素、氯吡脲的響應更高，4-硝基苯酚鈉的響應稍低，由于赤霉素是響應值最低的成分，所以以其為參照最終選取5 mmol·L-1甲酸銨-乙腈作為流動相。

3.2質譜條件的優化 取混合對照品溶液(50 ng·mL-1)進樣，自動優化離子源參數。由于赤霉素和4-硝基苯酚鈉是負模式，響應值較低，進行了分段，在第二段加電壓300 V。

3.3提取方式的選擇 本研究同時考察QuEChERS方法，該法是一種快速、簡便的凈化方法，已被廣泛應用于食品中植物生長激素的前處理[14-15]。筆者在本實驗精密稱取知母粉末3 g，采用含有無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺固相吸附劑、C18、石墨化炭黑的鹽包進行凈化。實驗結果表明丁酰肼、矮壯素、助壯素回收率較低，無法達到分析要求。采用溶劑提取后直接進樣，回收率可達70%，干擾較少且操作簡便。

3.4結果分析 目前通行的植物生長調節劑限量標準主要有4個：歐盟標準、國際食品法典委員會標準、日本標準、美國標準[16-17]。我國農藥類標準逐步細化完善，現行有效標準是GB.2763-2016，目前我國規定小麥、玉米、棉籽中矮壯素最高殘留量分別為5，5，0.5 mg·kg-1，日本規定茶葉中矮壯素最低殘留限量0.5 mg·kg-1，歐盟委員會規定矮壯素最低殘留限量為0.1 mg·kg-1，但均未對中藥飲片中殘留限量做出明確規定。參考以上限度規定，檢出樣品矮壯素含量較低，處于安全范圍內。

3.5完善植物生長調節劑殘留標準的建議 近年來，植物生長調節劑在中藥材種植中被廣泛應用，但其對中藥材質量的影響復雜，也缺乏大量的相關安全性有效性研究。部分藥農為追求高產量高效益，在中藥材種植過程中往往過量使用和不當使用。為實現有效監管，有必要對不同類別植物生長調節劑在中藥材中的殘留量帶來的安全性和有效性進行風險評估，分等級完善殘留量標準，科學指導藥農合理應用，在安全范圍內增產增效。