金蓮花白粉病病原菌鑒定△

李勇，王蓉，丁萬隆

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

金蓮花Trollius chinensisBge.為毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，始載于《本草綱目拾遺》，富含黃酮類、有機酸類、生物堿類、香豆素類化學成分，具有明顯的清熱解毒、抗菌消炎等藥理活性[1]，對咽炎、急慢性扁桃體炎、急性中耳炎、急性結膜炎、急性骨膜炎、上呼吸道感染等有較好臨床療效[2-3]。金蓮花片、金蓮花口服液、金蓮花膠囊、金蓮花顆粒和金蓮花潤喉片被《中華人民共和國藥典》2020年版收錄[4]。目前，中藥材市場上銷售的金蓮花主要依賴人工栽培。河北省承德、張家口地區作為我國藥用金蓮花的主產區，集約化、大規模人工栽培為金蓮花病菌繁衍創造了有利條件，導致以前零星發生的病害逐漸上升為主要病害，且為害逐年加重，對金蓮花種植業構成較大威脅。

筆者2018 年在河北省圍場縣調查發現，3 年生金蓮花植原體病的發生率達20%～30%[5]，而白粉病發病率則高達60%，對金蓮花植株生長、種子及花的產量和品質均造成嚴重影響，但迄今未見有關金蓮花白粉病的病原菌記錄及研究報道。為此，本研究在基地調研基礎上，結合病害發生及為害特征、病菌顯微形態學觀察及核糖體脫氧核糖核酸（rDNA）-內轉錄間隔區（ITS）序列比對分析，開展了金蓮花白粉病的病原鑒定工作，為深入開展金蓮花白粉病菌的生物學研究及病害綜合防控提供參考。

1 材料

1.1 樣品

3 年生金蓮花白粉病病株于2018 年8 月采自河北省承德市圍場縣金蓮花人工種植基地（E116°16′2.567″，N40°1′59.998″），由中國醫學科學院藥用植物研究所丁萬隆研究員鑒定為金蓮花Trollius chinensisBge.。采集的金蓮花白粉病樣品帶回實驗室，用于后續開展金蓮花白粉病病原菌鑒定工作。

1.2 儀器

XSP-12CA 型生物顯微鏡（上海光學儀器廠）；T100?型熱循環聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（Bio-Rad 公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 試藥

TaqDNA 聚合酶（日本TaKaRa 公司）；真菌基因組DNA 提取試劑盒（美國Omega 公司）；DNA 凝膠回收試劑盒（北京匯天東方生物技術有限公司）；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 病原菌形態學觀察

取載玻片1張，中央加入無菌水1滴。小心取出金蓮花白粉病樣本，用無菌手術刀片從金蓮花莖稈或葉片上刮取少量白粉菌，放入無菌水中，輕輕蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察白粉菌閉囊殼、子囊、子囊孢子及附屬絲形態特征。

2.2 病原菌分子鑒定

用無菌手術刀片從金蓮花白粉病株的莖稈、葉柄及葉片上小心刮取白粉菌0.1 g，轉入事先冷卻的1.5 mL 離心管中，液氮冷卻下充分研磨。白粉菌基因組DNA 用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取，具體提取步驟參照試劑盒說明。白粉菌rDNAITS 區段擴增引物ITS1/PM6 用于供試白粉菌基因組DNA 樣本擴增[6]。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及DNA 凝膠回收試劑盒純化后，交北京擎科新業生物技術有限公司測序。相關序列在美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站經BlastN 程序與GenBank 已知白粉菌序列進行比對，MegaX 軟件鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）構建系統發育樹。

3 結果與分析

3.1 病害癥狀

白粉病每年7 月中旬至9 月上旬在金蓮花產區流行，成株期金蓮花發病較重。病害發生初期，金蓮花莖稈、葉柄及葉片局部出現白色粉狀霉層，莖稈及葉片顏色無明顯變化（圖1）；隨病情發展，被霉層覆蓋的部位開始出現黑褐色病斑，不規則形，并逐漸串聯成片（圖2）；最終，霉層轉為淺褐色，上面密布白粉菌閉囊殼（圖3）。白粉病為害輕則造成金蓮花減產，嚴重者造成金蓮花早衰甚至死亡。

圖1 金蓮花莖稈上的菌絲層

圖2 金蓮花莖稈上的菌絲及閉囊殼

圖3 金蓮花葉片及植株基部為害狀

3.2 病原菌形態特征

金蓮花白粉菌閉囊殼聚生，暗褐色，近球形，直徑為60～100 μm，壁細胞不規則多角形，有凸起；每個閉囊殼內僅有1個子囊，內含8個淺褐色、卵圓形的子囊孢子（圖4）；附屬絲多根，著生于子囊果一側，菌絲狀，淺褐色，有隔膜，直徑為4～6 μm（圖5）。

圖4 金蓮花白粉菌閉囊殼

圖5 金蓮花白粉菌閉囊殼及附屬絲結構

3.3 病原菌分子鑒定

經ITS 引物擴增，得到1 條長485 bp 條帶（GenBank登錄號：MT956681）。BLAST分析結果表明，金蓮花白粉菌ITS 擴增序列與叉絲單囊殼屬白粉菌Podosphaera fuliginea（MF543026、AB046986）的序列同源性最高，分別為98.88%、98.73%。與P.gunnerae（AB525924、AB525923）序列同源性也較高，分別為98.03%、97.77%。此外，與叉絲單囊殼屬P.fuliginea（MK779060、MT261949 等）、P.plantaginis（KY661120、KY661084、KY660808等）、P.xanthii（MN203658、MG647819等）、P.fusca（MT985559、AY739113、KJ438824等）、P.erigerontiscanadensis（KY661158、KY661089、KY661039 等）、P.macrospora（KY661098、KY661097、KY661099等）的同源性也超過96%。將上述同源菌株基于rDNA-ITS序列構建系統發育樹，供試金蓮花白粉菌與叉絲單囊殼白粉菌P.fuliginea聚為一支（圖6）。結合供試白粉菌閉囊殼、子囊等的顯微形態特征，將其鑒定為叉絲單囊殼P.fuliginea。

圖6 金蓮花白粉菌及其同源菌株基于rDNA-ITS序列構建的系統發育樹

4 討論

白粉菌為植物專性寄生菌，屬子囊菌門（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），新分類系統包括1 科15 屬650 余種[7]。白粉菌家族成員眾多，分類系統復雜，且在屬、種水平的分類上常有變化。白粉菌寄主范圍、專化性、閉囊殼內子囊及子囊孢子數目，特別是閉囊殼外附屬絲形態特征一直是白粉菌鑒定的重要依據[8-9]。隨著分子生物學及電鏡在系統進化研究中的應用，白粉菌屬級分類系統及進化理論發生了重大變化。無性型形態特征逐漸成為白粉菌屬分類的重要依據，閉囊殼外附屬絲形態在白粉菌屬級分類中不再重要，但仍可作為種級分類的參考依據[10-11]。

真菌rDNA-ITS序列在真菌種內既有高度的保守性，又存在豐富的種屬間變異。根據該特性，上述序列不僅能用于真菌純培養的分子鑒定，還可用于病原真菌及環境真菌群體的動態監測[12-13]。利用專用引物擴增白粉菌基因組ITS 區段，結合核酸序列同源性分析，同樣適用于白粉菌屬病原的分類鑒定研究[14-15]。

近年來，白粉病逐漸上升為金蓮花生產上的主要病害之一，導致罹患白粉病的金蓮花產量和品質明顯下降，對金蓮花種植業威脅較大。由叉絲單囊殼P.fuliginea引起的白粉病在新疆碎花婆婆納[16]、大波斯菊和黃瓜[17]、多肉長壽花[18]等植物上亦有報道。野生金蓮花上未見白粉病發生，推測栽培金蓮花白粉病系鄰近寄主或跨區傳播導致。

田間調查發現，金蓮花種植密度過大，局地小氣候相對濕潤，可能是造成金蓮花白粉病嚴重發生的主要原因，在金蓮花生產上應引起足夠重視。金蓮花以花入藥，病害高發時期與花盛開期部分重疊。因此，金蓮花生產上白粉病防治，應在加強田間管理前提下，盡可能在病害發生初期噴施高效、低毒、低殘留化學殺菌劑[19-20]或微生物制劑加以預防，且嚴格控制用藥次數和使用劑量。