基于網絡藥理學和分子對接法的益智清心方治療阿爾茨海默病作用機制探索△

劉佳妮，劉劍剛，韋云*，羅增剛，李浩

1.中國中醫科學院 西苑醫院，北京 100091；2.中國中醫科學院 研究生院，北京 100700；3.中國中醫科學院 西苑醫院 老年病研究所，北京 100091；4.北京市中醫藥管理局，北京 100053

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種常見的慢性進展性的神經退行性疾病，起病隱匿、進展緩慢，其特征是進行性記憶力下降，隨時程進展致喪失廣泛的認知功能[1]。AD 的潛伏期和前驅期較長（約20 年），平均臨床進展為8～10 年。據估計，該病在65 歲以上人群中患病率為10%～30%，發病率為1%～3%[2]。目前，全世界有4400 萬人患有AD，預計到2050 年，隨著人口老齡化，患病人數將是目前的3 倍以上[3]。在神經病理學上，AD 的主要特征是β-淀粉樣蛋白斑塊和tau蛋白的神經元纖維纏結等病理聚集性的蛋白病變[4]，多種遺傳和環境因素也參與其發病和進展。現代醫學認為，淀粉樣前體蛋白（APP）的分裂、APP 片段β-淀粉樣蛋白的產生及過度磷酸化的tau蛋白聚集會導致突觸強度降低、突觸丟失和神經退行性病變，而代謝降低、血管功能障礙和炎癥變化是AD 疾病過程的關鍵組成部分[5]。

中醫學認為AD 屬于“健忘”“呆病”范疇，疾病本質為本虛標實。李浩團隊[6-7]根據20 多年臨床經驗，在開展系列臨床和基礎研究并取得較好療效的基礎上[8-10]，確立老年性癡呆中醫“虛-瘀-濁-毒”有害網絡的病機學說，明確腎虛是其主要病理基礎，血瘀、痰濁、毒邪是重要致病因素[11]。益智清心方（YiZhi QingXin Formula，YZQXF）原名為扶正祛邪方，是由周文泉教授的臨床經驗方還腦益聰方（制何首烏、黨參、川芎、石菖蒲、黃連）化裁而來，含有人參、黃連、川芎3 味藥。還腦益聰方從“虛-損-瘀-毒”的病理機制治療AD，具有簡、便、廉、驗的優勢，具有較好的臨床療效[12]。細胞實驗顯示，YZQXF 可通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路的過度激活，改善溶酶體功能，促進細胞自噬，增加β淀粉樣前體蛋白（APP）-早老素-1（PS1）雙轉基因阿爾茨海默病（AD）模型細胞的活性，從而降低Aβ蛋白的表達[13]，動物實驗證明其能夠改善N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）/蛋白磷酸酶2（PP2A）/tau 通路相關蛋白的異常表達，減輕SAMP8 小鼠認知功能的下降[14]。此外，YZQXF 還可以調節腸道菌群結構并提高自然衰老大鼠的空間學習記憶能力[15]。

目前AD 在世界范圍內仍是無法治愈的疾病，大多數藥物只針對部分認知或運動缺陷的癥狀治療，療效不佳，接受率低。在針對AD 的預防和治療方面，中藥表現出巨大的生命力，具有良好的開發前景，值得進一步深入研究。網絡藥理學是研究中藥復方多成分、多靶點作用機制的有效方法之一，前期實驗和臨床研究證實YZQXF 治療AD 具備一定的優勢，但缺乏對其藥理學機制的整理歸納。本研究以YZQXF 的主要活性成分為研究對象，運用網絡藥理學方法構建成分-靶點-通路網絡，預測核心作用靶點，并進行富集分析，為后期深入探討YZQXF 治療AD 的作用機制及其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 YZQXF活性成分及對應靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php），以“人參”“黃連”“川芎”作為關鍵詞，檢索YZQXF中所有化學成分，根據各成分的藥動學吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數篩選可能的活性成分，按照口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 設置閾值，篩選潛在的具有較高活性的化合物。通過TCMSP 檢索活性成分對應的靶點。由于得到的靶點蛋白存在命名不規范的情況，利用靶點的UniProt號進行基因標準化，運用UniProt 蛋白數據庫（http://www.uniprot.org）篩選所得靶點的對應基因，將檢索條件設置為Organism：Homo sapiens（Human），利用Perl 5.30.0.1 軟件運行腳本，匹配靶點蛋白對應的基因信息，將藥物靶點信息中的基因全稱轉化為基因symbol方便后續分析。

1.2 AD靶點獲取

在GeneCards 數據庫（http://www.genecards.org）、OMIM數據庫（https://omim.org）、PharmGKB數據庫（https://www.pharmgkb.org）、TTD 數據庫（https://db.idrblab.net/ttd）、DrugBank數據庫（https://www.drugbank.ca）中以“Alzheimer′s disease”作為關鍵詞對AD 相關靶點進行檢索，對評分高的靶點進行篩查，獲得AD 發病過程中已知的可靠靶點，再將所得靶點基因UniProt 號在蛋白質數據庫UniProt中標準化。

1.3 YZQXF治療AD的網絡構建及分析

將所得的YZQXF成分靶點與疾病靶點對應關系導入Cytoscape 3.7.1軟件中，構建活性成分-疾病靶點相互作用網絡。利用基因/蛋白質相互作用檢索工具STRING 11.5 數據庫（https://string-db.org），設置置信度＞0.80，構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，獲得TSV 格式的PPI 關系后導入Cytoscape 3.7.1軟件中，通過CytoNCA插件，以度中心值（degree centrality，DC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method，LAC）和網絡中心性（network centrality，NC）拓撲參數值為篩選條件，選擇大于中位值的數據，進一步篩選得YZQXF 治療AD 的核心靶點，構建藥物成分-核心靶點-疾病網絡。

1.4 核心靶點基因功能富集和通路富集分析

通過R 4.0.2語言的Bioconductor軟件包（https://www.bioconductor.org）對YZQXF 治療AD 核心靶點的不同生物學過程、信號通路進行分析，獲得基因本體（GO）功能富集分析結果（Q＜0.05）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析結果（Q＜0.05）。

1.5 藥物成分-核心靶點分子對接驗證

為了驗證預測的YZQXF活性成分和核心治療靶點的可信度，利用分子對接模擬軟件AutoDock Vina 1.1.2 對關鍵藥效成分與核心靶點進行受體-配體對接模擬計算。從PubChem 數據庫（https://pubchem.nc-bi.nlm.nih.gov/）下載關鍵藥效成分的2D 結構，以.SDF 格式保存。用ChemOffice 將2D 結構轉換為3D 結構。用UniProt 蛋白數據庫查找核心靶點的蛋白ID，從PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白ID 的3D 結構，以.PDB格式保存。利用PyMOL 軟件去除水分子及小分子配體。用AutoDockTools軟件對蛋白受體加氫，并將受體和配體的文件轉換為.PDBQT 格式保存。用AutoDock Vina 進行分子對接，找到蛋白受體和小分子配體的結合位置并計算出該位置下的自由能（結合能）。結合能越低，配體與受體結合構象越穩定，分子與靶點蛋白作用越突出。

2 結果

2.1 YZQXF中活性成分和對應靶點

在TCMSP數據庫（截至2020年9月）中篩選得到人參有效化合物有22 個、黃連有效化合物14 個、川芎有效化合物7個，共得到43個活性成分，見表1。43 個活性成分共獲得靶點484 個，去掉重復值，得到藥物靶點共185個。

表1 YZQXF中活性化合物信息

2.2 藥物靶點和疾病相關基因交集

對GeneCard、OMIM、PharmGKB、DrugBank、TTD 數據庫中收集到的AD 疾病作用的高分靶點進行篩選整合，共得到重要靶點2871 個，見圖1。通過韋恩圖篩選YZQXF 的成分靶點蛋白與AD 疾病靶點蛋白的交集，得到129個共同靶點，見圖2。

圖1 AD靶點整合

圖2 YZQXF與AD交集靶點韋恩圖

2.3 活性成分-疾病靶點網絡構建

將所得的YZQXF成分靶點與疾病靶點對應關系導入Cytoscape 3.7.1軟件中，構建活性成分-疾病靶點相互作用網絡，見圖3。通過CytoNCA 插件分析網絡關系中度值≥10 的活性成分，發現YZQXF 中最主要的活性成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、四氫小檗堿、豆甾醇、原阿片堿、楊梅酮、氧代小檗堿、巴馬汀、馬卡因、小檗堿等，見表2。

表2 YZQXF中主要的活性成分

圖3 YZQXF活性成分-AD疾病靶點相互作用網絡

2.4 PPI網絡構建

設置置信度＞0.80，得到PPI 網絡（圖4）包含128 個節點、517 條邊，平均度值為8.08。將PPI 網絡關系導入Cytoscape 3.7.1 軟件中，篩選得到YZQXF 治療AD 核心靶點10 個，包括絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1），原癌基因蛋 白Myc、Fos、Jun，MAPK14，細胞核轉錄因子-κB p65（RELA），蛋白激酶B1（Akt1），MAPK8，白細胞介素-1β（IL-1B），腫瘤蛋白p53（TP53），見圖5 和表3。其中，Fos、MAPK1、Jun 是度值較大的3 個節點，表明這些蛋白在PPI 網絡中具有重要意義，可能是YZQXF治療AD的關鍵靶點。

表3 YZQXF治療AD核心靶點

圖4 YZQXF治療AD靶點的PPI網絡

圖5 YZQXF治療AD的10個核心靶點PPI網絡

2.5 靶點的GO富集分析及KEGG通路分析

GO 富集分析得到條目2359 個，其中生物過程（BP）2064 個，細胞組分（CC）90 個，分子功能（MF）205 個，對Q值排序后取前10 名進行分析，見圖6。YZQXF 的活性成分治療AD 的相關靶點主要涉及對脂多糖的反應、對細菌來源的分子反應、對金屬離子反應、細胞對藥物的反應、細胞對化學壓力的反應、營養水平反應、血管直徑的調節、管徑調節、對氧水平反應等生物過程；細胞組分分析表明，靶點主要與膜筏、膜微域、膜區域、陷窩、突觸后膜、細胞質膜筏、突觸前膜、突觸膜等組分有關；分子功能分析表明，靶點主要涉及G 蛋白偶聯胺受體活性、神經遞質受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺綁定、突觸后神經遞質受體活性、類固醇激素受體活性、DNA 結合轉錄因子結合、核受體的活性、配體激活的轉錄因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合等，表明YZQXF 可以通過參與這些過程來發揮治療AD 的作用。

圖6 YZQXF治療AD靶點的GO富集分析

2.6 KEGG信號通路富集分析結果

用R 軟件對共同靶點進行KEGG 信號通路富集，共有168 個富集結果，主要涉及血液流變學、病毒感染、炎癥因子、免疫調節等。閾值設置為Q值＜0.05，對Q值排序后取前30 名進行分析，見圖7。KEGG富集最顯著的15條通路分別是流體剪切應力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、乙肝病毒（hepatitis B）、糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcomaassociated herpesvirus infection）、前列腺癌通路（prostatecancer）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、丙肝通路（hepatitis C）、人巨細胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection）、內分泌阻力（endocrine resistance）、恰加斯病（Chagas disease）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、小細胞肺癌（small cell lung cancer）、膀胱癌（bladder cancer）、甲型流 感信號通 路（influenza A）。結果表明，YZQXF 可能通過神經系統調控、免疫活性調節、炎性反應抑制、內分泌水平調節、抗病毒、癌癥中的蛋白多糖信號通路調控等方面發揮治療作用。

圖7 YZQXF治療AD靶點的KEGG信號通路富集分析

2.7 藥物成分-核心靶點分子對接驗證分析

選取YZQXF 有效活性成分中度值前5 的關鍵藥效物質與YZQXF 治療AD 最關鍵的3 個靶點蛋白Fos、MAPK1、Jun 進行分子對接驗證。對接結果如表4 所示，結合性最強的化合物-靶點相關的蛋白和化合物三維結構對接圖見圖8。YZQXF 中的關鍵活性成分與核心靶點結合能的均值為-8.41 kcal·mol-1（1 kcal=4.184 kJ），提示這些活性成分與核心靶點蛋白的結合性較強，其中槲皮素與靶點對接活性最好。

圖8 YZQXF治療AD的核心靶點與化學成分的對接模型

表4 YZQXF治療AD的藥物活性成分-核心靶點分子對接kcal·mol-1

3 討論

3.1 YZQXF成分分析

YZQXF以扶正為主，祛邪為輔，方中人參大補元氣、祛除邪氣、益智固脫，黃連清熱燥濕、瀉火解毒，川芎活血化瘀、行氣開郁，共奏益氣解毒化瘀之功。前期動物實驗研究表明，YZQXF 可減輕AD 小鼠的認知損害，改善NMDAR/PP2A/tau 通路相關蛋白的異常表達并調節腸道菌群結構[14-15]。本研究借助數據庫獲得YZQXF 活性成分43 個，成分-靶點網絡顯示的關鍵化合物包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、四氫小檗堿、豆甾醇等。藥理研究發現，槲皮素具有抗衰老、抗炎、抑制氧化、抑制神經毒性損傷、改善突觸系統功能等作用，有效緩解中樞神經系統神經退行性變，減輕AD 病理學特征，緩解認知障礙[16]；山柰酚具有抗腦缺血等藥理活性，并可通過提高海馬及皮層中的抗氧化蛋白DJ-1 的表達水平、增高腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性而提高機體大腦抗氧化水平發揮神經保護作用[17]；β-谷甾醇具有抗腫瘤、抗菌、抗微生物作用，可作用于神經系統，免疫系統[18]；小檗堿及其衍生物具有抗炎、抗病毒、治療心血管疾病等藥理活性作用，還對缺血大腦線粒體具有較好的保護作用，可改善皮層腦組織中乳過氧化物酶（LPO）含量，提高腦組織中SOD 水平[19]；豆甾醇具有抗氧化活性、抗腫瘤、抗炎等藥理作用[20]，對神經炎癥引起的神經退行性疾病具有治療潛力，還可通過激活雌激素受體增強膽堿能神經傳遞系統，從而改善認知功能、發揮抗AD的作用[21]。

3.2 關鍵靶點分析

本研究建立的成分-靶點網絡中關鍵活性成分治療AD 的作用與文獻報道一致。YZQXF 治療AD 的PPI 網絡分析得到核心靶點Fos、MAPK14、Jun、MAPK1、Myc、RELA、Akt1、MAPK8、IL-1B、TP53 等，蛋白類型涉及激酶、信號、轉錄因子、鈣結合蛋白、載體蛋白轉移酶等。Fos 和Jun 作為即早基因（IEGS），可以在特定的組合中形成二聚體復合物激活蛋白1（AP-1），而參與多種生長因子和細胞因子的基因轉錄，從而調控細胞增殖、分化、轉化及凋亡等過程[22]。已有研究提示，c-Jun 在學習記憶過程中具有特異性作用，抗c-Jun的低聚核苷酸可以一種程序特異性的方式影響學習記憶過程[23]，c-Jun N 末端激酶（JNK）可誘導促凋亡蛋白的表達、降低抗凋亡蛋白的表達。研究還顯示，突觸功能障礙、氧化應激和神經興奮性毒性等可誘導JNK通路激活，從而刺激神經元和突觸喪失、腦萎縮和腦室增大，加劇AD 的認知功能下降，目前JNK 抑制劑作為AD新的潛在療法成為研究熱點[24]。Tischmeyer等[25]認為誘導海馬c-Fos mRNA的表達是形成長期記憶的必要條件。MAPK14 是MAPK 的亞型，是一種對炎癥和氧化刺激敏感的激酶，目前已證明在APP-PS1 轉基因AD 小鼠的大腦中MAPK14/p38α蛋白的表達上調，并且進一步證實APP-PS1 小鼠中MAPK14 的遺傳缺陷可以通過促進BACE1 的自噬-溶酶體降解而減輕淀粉樣蛋白病理，表明抑制MAPK14 酶的活性作為緩解AD 大腦神經元關鍵生理缺陷的治療方法具有潛力[26]。另外，通過分子對接驗證得到YZQXF關鍵成分與這些靶點蛋白結合活性較佳，表明成分和靶點之間作用力較強，成分與靶點之間較好的結合力是YZQXF發揮治療作用的基礎。以上結果提示PPI 網絡中關鍵成分可靠性較好，可為下一步研究YZQXF 治療AD 的藥效物質基礎提供具體的思路與方向。

3.3 信號傳導通路分析

AD作為神經退行性疾病病理機制復雜，主要有遺傳、膽堿能神經元丟失、淀粉樣蛋白聚集、氧化應激、炎癥反應、線粒體功能紊亂等假說，目前認為AD 過程的2 種典型的病理特征是Aβ-淀粉樣斑塊沉積和過度磷酸化tau的神經原纖維纏結，治療策略包括抗淀粉樣蛋白、減少tua蛋白磷酸化和聚集、抗氧化、維持ACh 和減少神經炎癥等，治療目的在于減少大腦內病理產物負擔。GO 富集分析結果表明，YZQXF主要通過免疫炎癥反應、藥物代謝、營養調節、細胞適應性應激反應、血管機能調節、氧氣水平等生物過程影響體內病理過程。細胞組分分析表明，PPI 網絡靶點主要涉及膜筏、膜微域、突觸后膜、突觸前膜等組分。突觸功能障礙和突觸丟失是AD 早期出現的病理表現，AD 與中樞神經系統突觸數量的減少和突觸功能的改變密切相關，目前突觸喪失已被確立為AD 認知障礙的主要結構相關因素[27]，生物信號由突觸前膜釋放至后膜，Aβ沉積會影響到突觸信號的連接整合而導致突觸結構功能紊亂和丟失，Tau蛋白可通過破壞細胞轉運而對突觸產生毒性從而發生功能損害[28]。KEGG 通路富集分析中流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路，乙肝病毒信號通路，糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號通路及IL-17信號通路等富集顯著性高且靶點數較多，這些通路具有血管穩態調節、病毒處理、調節免疫炎癥反應、抗癌、抗氧化、代謝調節等作用。流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路與血管功能有關，血管機制參與許多神經系統疾病的發生，特別是血腦屏障（BBB）功能障礙與AD 的嚴重程度有關，腦血管系統作為中樞神經系統疾病后神經元的重要治療靶標，流體剪切應力等在血管穩態和病理生理中起關鍵作用，可調節發達血管和受動脈粥樣硬化病變影響血管的重塑性[29]。

Mastroeni 等[30]根據KEGG 分析得到AD 重要的病毒之一是乙肝病毒（HBV），并在HBV 陽性對照、遺忘性輕度認知障礙和HBV 陽性AD 病例中使用HBV 核心抗體，結果顯示，HBV 免疫反應性隨著疾病病理的增加而增加，提示HBV 在AD 患者大腦中具有潛在作用；Ji等[31]將tau294-305表位與乙肝病毒核心蛋白（HBc）主要免疫優勢區進行基因融合，P301S 小鼠接種后可顯著改善記憶力和認知能力下降，修復Tau 蛋白突觸缺陷；晚期糖基化終產物（AGE）也被證實與AD、衰老、炎癥和癌癥的發病機制有關，AGEs抑制機體抗氧化反應、影響酶活性并可通過多種途徑引起神經毒性損傷、促進神經元凋亡，在AD 患者大腦中，可溶性晚期糖基化終末產物受體（RAGE）表達增加且與Aβ共存于神經元和小膠質細胞中[32]，AGE 與RAGE 結合可引起細胞內信號轉導，激活核轉錄因子-κB（NF-κB）而導致組織穩態的惡化；IL-17則參與AD的免疫炎癥反應，并且在AD 的發生發展過程中起著重要作用，IL-17可活化膠質細胞，并與多種細胞因子產生協同作用，放大炎癥反應，損傷血腦屏障。動物實驗顯示，IL-17 中和抗體（IL-17Ab）可減輕Aβ誘導的小鼠神經炎癥和行為癥狀[33]。體外實驗證明IL-17 在AD 炎癥早期階段對神經系統可能起保護作用，晚期則會加重AD病理損傷[34]。

綜上所述，本研究從網絡藥理學角度系統分析了YZQXF治療AD的分子機制，共獲得個43活性成分，129 個靶點。結論本網絡藥理研究可揭示多靶點、多組分YZQXF 治療AD 的潛在機制，為研究其機制提供科學依據。