航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境模型大鼠大腦皮層形態(tài)及蛋白表達(dá)的變化

武曉瑞， 尹一淑， 劉軍蓮， 范全春， 趙 爽， 李勇枝*

(1.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心， 北京 100094； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系， 哈爾濱 150001)

1 引言

航天環(huán)境下的應(yīng)激因素是多方面的，如超重、失重、噪聲、輻射和晝夜節(jié)律改變等物理應(yīng)激源，血液重分布、肌肉廢用和骨質(zhì)丟失等生理性應(yīng)激源，空間狹小、社會(huì)隔離、限制、睡眠剝奪、工作高負(fù)荷、高危險(xiǎn)等心理應(yīng)激源，乘員異質(zhì)性、性格沖突、文化與性別差異、人際摩擦等人際應(yīng)激源。 這些應(yīng)激因素產(chǎn)生的一系列反應(yīng)均影響著乘員的心理和生理健康，影響飛行任務(wù)的完成，甚至可能造成災(zāi)難性后果。

Bremner研究表明，慢性應(yīng)激引起下丘腦－垂體－腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis， HPA axis)功能長(zhǎng)期異常，糖皮質(zhì)激素持續(xù)處于高水平導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞增值受到抑制，神經(jīng)元受損萎縮引起神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷。 陳海龍等檢測(cè)了尾吊一周SD 大鼠腦區(qū)記憶相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)學(xué)習(xí)相關(guān)蛋白通路活化能力減弱；Iqbal 等通過(guò)比較O16/O18 標(biāo)記的綜合蛋白質(zhì)組學(xué)策略，檢測(cè)了7 d 尾吊大鼠模型的差異蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了132 個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中25 個(gè)蛋白與各種信號(hào)級(jí)聯(lián)相關(guān)并且涉及重要的內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能，表明微重力環(huán)境對(duì)腦部信號(hào)傳遞產(chǎn)生了一定的影響。 因此長(zhǎng)期處于航天應(yīng)激環(huán)境下會(huì)引起機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的生化改變，出現(xiàn)情緒異常，甚至導(dǎo)致大腦器質(zhì)性損害。 而與情緒密切相關(guān)的是大腦皮層和邊緣系統(tǒng)，在應(yīng)激反應(yīng)中是高位調(diào)節(jié)中樞，更是應(yīng)激反應(yīng)最容易累積的敏感區(qū)域。

近年來(lái)有關(guān)航天復(fù)合應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究很少公開發(fā)表。 抗體芯片技術(shù)是一種高通量技術(shù)，能夠利用少量樣品篩選差異表達(dá)蛋白，全面、定量地分析蛋白種類和數(shù)量的改變，并且通過(guò)結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，即可預(yù)測(cè)航天應(yīng)激環(huán)境的影響機(jī)制。 本文通過(guò)神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)、抗體芯片檢測(cè)技術(shù)及通路富集分析，對(duì)模擬長(zhǎng)期航天應(yīng)激環(huán)境下大鼠大腦皮層及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化進(jìn)行探究，為進(jìn)一步探究航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境對(duì)大鼠大腦皮層的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 方法

2.1 動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)選用健康成年6 周齡雄性SD 大鼠，SPF級(jí)，體重(200±10)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)入后，適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)一周。

主要試劑:尼氏染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；PBS(美國(guó)Hyclone 公司)；RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；KAM－850 antibody microarray 試劑盒(加拿大Kinexus公司)；發(fā)光液(美國(guó)Millipore 公司)；辣根酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；GAPDH 抗體(sc－47724)(美國(guó)Santa Cruz 公司)；BDNF (ab75040)(美國(guó)Abcam 公司)；PI3K(4249)、 p-PI3K (2971)、 AKT (9272)、 p-AKT(9271)、mTOR (2983)、p-mTOR (2971)、GSK－3β(9315)、p-GSK－3β(9336)、CREB (9197)、p-CREB (9198)、JNK(3708)、p-JNK (4668)、p38(8690)、p-p38 (4511)(美國(guó)CST 公司)。

主要器材:全自動(dòng)真空脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、載玻片(德國(guó)Leica 公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；KAM－850 抗體芯片(加拿大Kinexus 生物信息公司)；激光陣列掃描儀(美國(guó)Perkin-Elmer 公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF 公司)；旋渦混勻器(北京六一儀器廠)；勻漿儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)；超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell 公司)；干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)。

2.2 動(dòng)物分組與造模

大鼠隨機(jī)分為2 組，分別為空白對(duì)照組(Control，Ctrl)與航天復(fù)合應(yīng)激模型組(Model，Mod)，每組10 只。 其中，Ctrl 組每籠放入5 只大鼠，在正常條件下飼養(yǎng)，每日保持12 h 光照和12 h 黑暗晝夜交替。 模型組在模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境下飼養(yǎng)。 模擬航天復(fù)合應(yīng)激條件包括:孤養(yǎng)、尾吊、噪聲、晝夜節(jié)律改變。 每籠飼養(yǎng)1 只大鼠，可自由活動(dòng)和進(jìn)食水，尾吊籠四周安裝毛玻璃，使籠中大鼠不能看到外部，造成相對(duì)幽閉隔離的環(huán)境。 采用改進(jìn)的尾部懸吊法使大鼠軀體與水平呈30°角，后肢懸垂不碰觸地面。 動(dòng)物房的四角各放置1 個(gè)揚(yáng)聲器，用白噪聲發(fā)生器發(fā)出穩(wěn)態(tài)噪聲，經(jīng)均衡器、功率放大器傳至揚(yáng)聲器，聲強(qiáng)控制在(65±2)dBA 范圍內(nèi)，每天持續(xù)播放12 h。 利用微電腦時(shí)控開關(guān)設(shè)置照明為45 min 開和45 min 關(guān)交替，模擬近地軌道90 min 繞地一周的晝夜節(jié)律變化。造模時(shí)間共持續(xù)6 周。

2.3 尼氏染色觀察大腦皮層形態(tài)

造模完成后，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。 先用生理鹽水灌注，待大鼠肝臟變白后，換成4%多聚甲醛灌流，直到大鼠肝臟變硬，尾巴僵硬為止。 大鼠斷頭處死，在冰上剝離全部大鼠大腦及皮層組織。 取4 只大鼠皮層組織放入4%的多聚甲醛溶液中，浸泡24 h 后漂洗、脫水、石蠟包埋并切片，余下的6 只用于后續(xù)抗體芯片分析及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。 將腦片置于焦油紫溶液中，室溫下染色30 min。 放入Nissl Differentiation 中進(jìn)行分化，在顯微鏡下觀察至背景接近于無(wú)色為止。 另外，熒光顯微鏡下對(duì)皮層進(jìn)行組織學(xué)觀察及拍照，并對(duì)不同尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元區(qū)域進(jìn)行雙盲計(jì)數(shù)。

2.4 抗體芯片篩選差異蛋白

取剩余6 只大鼠大腦皮層組織在冰浴中進(jìn)行勻漿，并超聲粉碎。 4 ℃環(huán)境下，離心轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，旋轉(zhuǎn)10 min，取上清于1.5 mL 離心管中。 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品蛋白濃度。 分裝一半用于抗體芯片分析，其余用于蛋白免疫印跡分析。

用KAM－850 antibody microarray 芯片進(jìn)行各組件無(wú)偏差信號(hào)蛋白特征分析。 將各組抽提后的蛋白質(zhì)用試劑盒中提供的Cy5 和Cy3 兩種不同顏色的熒光分子分別標(biāo)記，洗去多余標(biāo)記分子。將KAM－850 抗體芯片在封閉緩沖液中封閉1 h，在孵化緩沖液中將芯片與蛋白樣品孵育2 h，用激光陣列掃描儀在540 nm 處掃描抗體芯片，搜索差異蛋白相對(duì)應(yīng)的基因。 選用京都基因與基因組( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)的信號(hào)通路，采用超幾何分布的計(jì)算方法，用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate，F(xiàn)DR)校正P-value，選取的閾值為0.05，最后獲得差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG 信號(hào)通路。

2.5 蛋白免疫印跡分析

將加入上樣緩沖液的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)。 電壓80 V，30 min 左右時(shí)待條帶跑至分離膠時(shí)，將電壓改為120 V，繼續(xù)進(jìn)行90 min。剪取適合大小，厚度為0.22 μm 的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜，放入甲醇浸泡10 s，之后和濾紙、轉(zhuǎn)膜夾、海綿一起浸泡于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 恒定電流300 mA，根據(jù)目標(biāo)蛋白分子大小進(jìn)行，電轉(zhuǎn)60 ～90 min 后將PVDF 膜迅速放入封閉緩沖液中，室溫封閉2 h，然后用TBST 洗膜5 min。 按照抗體說(shuō)明書的稀釋比例，用含1% BSA 的TBST 配置2 mL 一抗溶液。根據(jù)蛋白Marker 切下與目的蛋白相應(yīng)的PVDF膜，放入一抗中，于4 ℃冰箱輕搖孵育過(guò)夜。 之后在TBST 中洗膜3 次，每次10 min。 用封閉緩沖液配制辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育液，濃度1 ∶5000。 將PVDF 膜加入二抗孵育液中，室溫下?lián)u床孵育2 h。 之后在TBST 中洗膜4 次，每次10 min。將Millipore 發(fā)光液A 液和B 液按1 ∶1比例加入孵育盒中混勻，將待測(cè)PVDF 膜浸泡其中2 min，取出后放入化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)中顯影、曝光，并用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行正態(tài)性分析和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析進(jìn)行多樣本間比較，用Bonferroni 修正差別檢驗(yàn)法進(jìn)行兩組間比較，并用GraphPad Prism 5 作圖。

3 結(jié)果

3.1 大鼠大腦皮層形態(tài)

顯微鏡下對(duì)尼氏染色的大腦皮層組織切片進(jìn)行觀察，如圖1 所示。 與Ctrl 組相比，Mod 組神經(jīng)元數(shù)目減少，間隙變大，尼氏染色相對(duì)較弱。

圖1 模擬航天復(fù)合應(yīng)激對(duì)大鼠大腦皮層組織形態(tài)的影響Fig.1 Effects of simulated spaceflight composite stress on the morphology in cerebral cortex

對(duì)皮層神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)分析，見圖2。 與Ctrl 組相比，Mod 組神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(＜0.01)，提示模擬長(zhǎng)期航天應(yīng)激環(huán)境會(huì)造成大鼠大腦皮層神經(jīng)元損傷(其中＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

圖2 模擬航天復(fù)合應(yīng)激對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)元數(shù)目的影響Fig.2 Effects of simulated spaceflight composite stress on the numbers of intact neurons in cerebral cortex

3.2 大鼠大腦皮層蛋白表達(dá)

3.2.1 抗體芯片掃描圖像

用激光陣列掃描儀對(duì)抗體芯片進(jìn)行掃描，得到圖3。 左側(cè)為Ctrl 組皮層組織的掃描圖像，右側(cè)為Mod 組皮層組織的掃描圖像。 其中，紅色點(diǎn)表示豐度增加，綠色點(diǎn)表示豐度降低，紅綠混合表示豐度沒有變化。

圖3 抗體芯片掃描圖像Fig.3 Antibody-based protein microarray scanning images

3.2.2 抗體芯片檢測(cè)蛋白變化

抗體芯片共檢測(cè)了854 個(gè)蛋白分子。 根據(jù)Kinexus 公司的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足Z-ratio ≥±1.5%，Error Range ≤30， Globally Normalized Median Value ≥271 和Flags ＝0 四個(gè)指標(biāo)要求的分子才被認(rèn)為發(fā)生了顯著變化，其中Z-ratio 表示對(duì)照樣品和處理樣品之間的最大變化，Error Range 表示全局歸一化網(wǎng)絡(luò)信號(hào)強(qiáng)度的緊密程度，Globally Normalized Median Value 代表全局標(biāo)準(zhǔn)化中值，F(xiàn)lag 表示形態(tài)和背景的斑點(diǎn)質(zhì)量。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦皮層組織中，Mod 組與Ctrl 組相比，顯著差異蛋白有28 個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有21 個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有7 個(gè)，如表1 所示。

表1 大腦皮層Mod 組與Ctrl 組差異蛋白列表Table 1 Expressed differential proteins between Mod and Ctrl groups in cerebral cortex

3.2.3 抗體芯片檢測(cè)差異蛋白的通路活性

通過(guò)搜索芯片差異蛋白相對(duì)應(yīng)的基因，進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得出發(fā)生顯著改變的信號(hào)通路。 圖4 為大腦皮層組織顯著改變的通路，軸表示為富集分析統(tǒng)計(jì)顯著性值p value 進(jìn)行－log轉(zhuǎn)換后的值，且數(shù)值越大表示富集分析越顯著。 Mod 組和Ctrl 組相比，變化較為顯著的信號(hào)通路有脂肪細(xì)胞因子(Adipocytokine)、MAPK、p53等信號(hào)通路。

圖4 模擬航天應(yīng)激環(huán)境模型影響大腦皮層組織的信號(hào)通路Fig.4 Altered signaling pathways in different groups in cerebral cortex

3.3 Western Blot 驗(yàn)證差異蛋白

在抗體芯片中，Mod 組大腦皮層MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性發(fā)生了明顯變化。 在哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的5 種MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，ERK1/2通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，JNK 和p38-MAPK 通路在炎癥和細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。 為了證實(shí)這種變化，本文用免疫印跡法對(duì)MAPK 的3 個(gè)亞族ERK1/2、JNK 和p38-MAPK 進(jìn)行了檢測(cè)。

圖5 為大腦皮層組織的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在大腦皮層組織中，與Ctrl 組相比，Mod 組ERK1/2、JNK 和p38-MAPK 的磷酸化水平發(fā)生微弱提高。 結(jié)果提示模擬長(zhǎng)期航天飛行可能對(duì)MAPK 通路產(chǎn)生一定程度的影響。

圖5 模擬航天應(yīng)激環(huán)境對(duì)MAPK 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of spaceflight composite stress on the expression of key proteins in the MAPK pathway

4 討論

考慮到長(zhǎng)期太空飛行特殊和復(fù)雜的極端環(huán)境，本文通過(guò)尾吊、時(shí)序變化、孤養(yǎng)、噪聲因素模擬航天環(huán)境，建立慢性應(yīng)激大鼠模型，致力于構(gòu)建一個(gè)比較理想和全面的航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境模型，能夠更貼合地模擬空間站中環(huán)境，盡管如此，本模型仍舊具有一定的局限性，如難以模擬飛行乘組人員之間的人際關(guān)系等。

尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，主要合成更新細(xì)胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類等神經(jīng)調(diào)質(zhì)，結(jié)構(gòu)異常與情緒抑郁、認(rèn)知損害等癥狀密切相關(guān)。 郭純等研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激大鼠海馬尼氏體減少，顏色變淺，細(xì)胞間隙增加。 本文用尼氏染色法觀察模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境模型大鼠大腦皮層的神經(jīng)元形態(tài)的改變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠大腦皮層神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)有明顯改變，提示模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境會(huì)造成大鼠皮層組織神經(jīng)元損傷。

高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)，能預(yù)測(cè)生命活動(dòng)規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)，為疾病機(jī)制的闡明提供理論依據(jù)和解決途徑，還被廣泛用來(lái)確定藥物的細(xì)胞信號(hào)分子和靶標(biāo)蛋白。 抗體芯片是最常用的蛋白質(zhì)芯片中的一種，通過(guò)芯片上的抗體和待測(cè)樣品中的抗原進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)成百上千種蛋白表達(dá)豐度。 其特異性強(qiáng)，敏感度高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。 本文研究應(yīng)用抗體芯片技術(shù)檢測(cè)模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境后大鼠大腦皮層的蛋白變化，發(fā)現(xiàn)有顯著差異的蛋白28 個(gè)，其中21 個(gè)表達(dá)上調(diào)，7 個(gè)表達(dá)下調(diào)。接著利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了通路富集分析，發(fā)現(xiàn)了其中與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的MAPK 信號(hào)通路變化較為明顯。

MAPK 通路控制著細(xì)胞的多種生理過(guò)程，在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。 ERK1/2 通路和p38－MAPK 通路都屬M(fèi)APK 通路。 ERK 通路發(fā)揮促細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的作用，p38－MAPK 通路在應(yīng)激反應(yīng)中促細(xì)胞凋亡。 Li 等研究表明Ras/ERK/p38－MAPK 信號(hào)通路參與慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠神經(jīng)可塑性和抑郁樣行為的調(diào)節(jié)。 本文也對(duì)此通道上的多個(gè)蛋白進(jìn)行了免疫印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其磷酸化水平均有提高的趨勢(shì)。 因此可以合理推測(cè)，模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境會(huì)導(dǎo)致大鼠大腦皮層腦組織形態(tài)發(fā)生改變，也會(huì)影響皮層組織中相關(guān)蛋白的改變，這種改變可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路造成的。

5 結(jié)論

本文探究了航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境對(duì)模型大鼠大腦皮層腦組織形態(tài)及相關(guān)蛋白的影響，結(jié)論如下:

1)模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境會(huì)造成模型大鼠皮層組織神經(jīng)元損傷。

2)模擬航天復(fù)合應(yīng)激環(huán)境后大鼠大腦皮層的蛋白發(fā)生明顯變化，其中MAPK 和p53 通路的變化較為明顯。