載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系的穩定性

張辰辰， 程佳馨， 戴竹青， 何偉偉， 耿寧寧， 李 瑩， 李大婧， 宋江峰

(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013；3.寶雞職業技術學院，陜西寶雞 721013)

葉黃素是一種重要的含氧類胡蘿卜素，可以保護視網膜免受光損傷，對老年性黃斑變性病、白內障、青光眼和糖尿病視網膜病變、色素性視網膜炎等眼疾有預防和緩解作用。此外，葉黃素還具有抗氧化、抑制炎癥、抗癌的功效。但是由于葉黃素多烯鏈結構不穩定，在加工貯藏過程中易受pH值、光照、溫度等環境因素的影響而降解損失，同時其水溶性較差，因而利用增溶劑、兩親性聚合物等天然材料對葉黃素進行物理包埋，制備納米化葉黃素穩定復合體系將有助于擴大葉黃素在食品、藥品領域的應用范圍。

甜菊苷由親水性的雙側糖基(葡萄糖基和鼠李糖基)和疏水性的甜菊醇基連接構成，這種雙親性的分子結構與三萜皂苷類較為相似。Zhang等研究發現，甜菊糖苷類物質具有增溶特性，利用甜茶苷制備水溶性的姜黃色素制劑，具有良好的穩定性和生物活性。筆者所在課題組前期利用天然甜菊苷兩親性結構性質制備出甜菊苷-葉黃素復合物，顯著提高了葉黃素的水溶性和生物利用率，但體系穩定性較差。研究發現，植物蛋白分子具有良好的生物兼容性、降解性、乳化性及表面活性，能顯著提高復合體系的物理穩定性。蛋白質分子因含有大量疏水性、親水性基團，具有表面活性，能產生乳化作用，常被用于包埋脂溶性功能物質。Wang等研究發現，大豆分離蛋白負載白藜蘆醇后，乳狀液物理穩定性和氧化穩定性得到了提高。李燕等用乳清分離蛋白-麥芽糖糊精美拉德反應的產物包埋-胡蘿卜素，發現此復合物能夠顯著降低乳狀液的粒徑，提高-胡蘿卜素對光熱的穩定性。本研究利用鷹嘴豆分離蛋白和甜菊苷為材料制備載葉黃素的復合體系，研究pH值、鹽離子、凍融處理、不同貯藏條件對鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系穩定性的影響及人工模擬胃腸液中復合體系的穩定性，以期為葉黃素復合體系在功能食品和飲料中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素(含量≥90%)，購自上海源葉生物科技有限公司；鷹嘴豆分離蛋白(含量≥85%)，購自陜西帕尼爾生物科技有限公司；甜菊苷(含量≥90%)，購自上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶、豬膽鹽、胰脂肪酶、糖化酶，均為生化試劑，購自南京奧多福尼生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二甲基亞砜、乙酸、乙醇、鹽酸、氯化鈉、氯化鈣、氫氧化鈉，均為國產分析純。試驗分別于2019年2—5月、2020年4月在江蘇省農業科學院農產品加工研究所實驗室進行。

1.2 儀器與設備

超聲波處理器(UP400S)，德國Hielscher公司；恒溫液浴循環兩用槽(7HD120)，英國Prima公司；真空旋轉蒸發儀(RE-52A)，上海亞榮生化儀器廠；數顯測速恒溫磁力攪拌器(85-2A)，常州市金壇華偉儀器廠；臺式高速離心機(TG16-WS)，湖南湘儀離心機儀器有限公司；電子分析天平(BSA224S)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(UV-6300)，上海美譜達儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHZ-82)，常州國宇儀器制造有限公司；納米粒度儀(Zetasizer Nano-ZS90)，英國Malvern公司；全自動色差計(CR-400)，日本柯尼卡美能達公司；pH計(PHS-5型)，上海康儀儀器有限公司；電熱恒溫培養箱(DNP-9052BS-Ⅲ)，上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系的制備 參考李青等的方法并加以修改。將鷹嘴豆分離蛋白分散到10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中(pH值為7.0)，于室溫、500 r/min條件下磁力攪拌2 h。蛋白溶液使用超聲波破碎儀進行超聲處理，時間為10 min，振幅為37.5 μm，脈沖比為0.5。將超聲處理后的蛋白溶液離心(8 000 r/min)10 min，獲得的上清液即為蛋白納米溶液。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)配制甜菊苷溶液。將甜菊苷溶液和蛋白納米溶液混合，磁力攪拌5 min。將溶有葉黃素(20 mg/mL)的乙醇溶液倒入磁力攪拌的甜菊苷-蛋白溶液中，攪拌5 min后進行超聲處理，超聲條件：脈沖比0.65，振幅72 μm，時間6 min，甜菊苷質量分數為0.5%。超聲結束后濃縮去除乙醇，即獲得載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系(CPI-STE-LUT)。

1.3.2 pH值對葉黃素復合體系穩定性的影響 測定pH值為3、4、5、6、7、8條件下鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系的平均粒徑、葉黃素乳化產率，用0.1%～1.0%乙酸和氫氧化鈉調節體系的pH值。

1.3.3 Na濃度對葉黃素復合體系穩定性的影響 分析添加0、10、20、30、40、60 mmol/L NaCl溶液后鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系的平均粒徑、葉黃素乳化產率。

1.3.4 凍融處理對葉黃素復合體系穩定性的影響 將鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系在-20 ℃冷凍12 h后常溫解凍(反復凍融3次)，測定其平均粒徑、葉黃素的乳化產率。

1.3.5 不同貯藏條件下葉黃素復合體系的穩定性 分別將50 mL鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系轉移至離心管中，在不同溫度(4、25、37 ℃)、避光、非避光條件下進行貯藏試驗。分別貯藏0、5、10、15、20、25、30 d后進行取樣，測定其平均粒徑、葉黃素保留率及色澤的變化。

1.3.6 模擬胃腸液中葉黃素復合體系的穩定性 將鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系進行胃液、腸液2個階段的模擬消化，整個過程在恒溫振蕩水浴系統中進行，溫度控制為37 ℃。取10 mL乳液，加入 20 mL 模擬胃液(含2 mg/mL NaCl、3.2 mg/mL胃蛋白酶)，調節pH值至1.2，在恒溫振蕩水浴鍋內消化1.5 h。再調節pH值為7.0，在上述溶液中繼續加入7.5 mL模擬腸液(含5 mg/mL膽汁鹽、10 mmol/L CaCl、150 mmol/L NaCl、2.4 mg/mL 胰脂肪酶、2.4 mg/mL糖化酶)，于恒溫振蕩水浴鍋中繼續消化6 h，分別在1、2、3、4、5、6 h取樣，測定葉黃素含量并計算葉黃素的保留率。

1.3.7 理化指標的測定

1.3.7.1 粒度 將鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復合體系用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7)稀釋100倍，采用納米激光粒度儀測量其粒徑，儀器設定散射光角度為90°，測定溫度為25 ℃，每個樣品至少重復測試3次，取平均值。

1.3.7.2 葉黃素含量 取100 μL樣液溶于 9.900 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，用紫外分光光度計在460 nm處測定其吸光度。標準曲線的繪制方法：精確稱取葉黃素標準品(溶于DMSO中)，配制成1～10 mg/L的標準溶液，在460 nm處測量吸光度，以葉黃素含量為橫坐標()、吸光度為縱坐標()繪制標準曲線。得到標準曲線方程為=46592 0-0005 6，=0.999 7。根據標準曲線方程確定樣液中的葉黃素含量。

1.3.7.3 葉黃素乳化產率 取新鮮制備的葉黃素復合體系，靜置1 h后測定葉黃素濃度，按照公式(1)計算葉黃素乳化產率：

(1)

1.3.7.4 葉黃素保留率 葉黃素保留率的計算方法見公式(2)：

(2)

1.3.7.5 溶液色澤的測定 使用CR-400全自動色差計測定溶液色澤，每次使用前分別進行黑板、白板校正，測定時取2 mL液體于樣品池中，測頭對準樣本發光3次后，記錄、、值，表示亮度值；表示紅綠值；表示藍黃值，色差值Δ描述待測樣品顏色變化，由、、通過計算得到，以空白試驗葉黃素乳液為參比標準溶液，注意不要漏光，重復測定3次。色差值(Δ)及飽和度值(Δ)通過公式(3)和(4)計算：

Δ=Δ+Δ+Δ)12；

(3)

Δ=(Δ+Δ)12。

(4)

2 結果與分析

2.1 酸堿穩定性

不同pH值條件下載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系(CPI-STE-LUT)的平均粒徑見圖1。可以看出，當pH值為4～9時，復合體系的平均粒徑隨著pH值的升高而大幅減小；當pH值為4～6時，體系的平均粒徑大于1 000 nm，出現絮凝、聚結和分層現象，可能因為鷹嘴豆分離蛋白的等電點(PI)在4.5～5.0范圍內，此時蛋白質的溶解度減小，所帶正負電荷恰好相等，沒有相同電荷互相排斥，粒子間相互聚集，進而發生絮凝沉淀，這與崔健等的研究結果相似；當pH值>7時，體系的平均粒徑在200 nm左右。在酸性條件下，CPI-STE-LUT三元復合體系的平均粒徑大于CPI-LUT二元復合體系，當pH值為8.0時，三元復合體系的粒徑最小，僅為196.28 nm，這可能是因為部分甜菊苷分子附著在鷹嘴豆分離蛋白顆粒表面，使蛋白質分子間的靜電引力減小，從而減少了顆粒間的相互聚集。

如圖2所示，葉黃素的乳化產率隨著pH值的提高而升高，在酸性條件下，其乳化產率低于80%，在中性及堿性條件下，其乳化產率均達80%以上。其原因可能是在酸性條件下，鷹嘴豆分離蛋白溶解度下降，導致體系的葉黃素乳化率降低，此外，葉黃素在酸性環境中發生共軛體系碳原子的質子化，加速了葉黃素的降解。對比發現，在中性和堿性條件下CPI-STE-LUT三元復合體系的葉黃素乳化率高于CPI-LUT二元復合體系。

2.2 耐鹽穩定性

如圖3所示，復合體系的平均粒徑隨著Na濃度的升高而增大，這與朱振寶等的研究結果相似，即Na離子會引起體系的不穩定。隨著離子強度的提高，復合體系中水相離子強度增加，在乳狀液中產生靜電屏蔽，從而降低粒子間的靜電排斥力，誘發粒子絮凝或聚合。并且當鹽離子濃度增大時，會引起蛋白質的鹽析作用，從而影響其溶解度，降低體系的穩定性。當Na濃度高于60 mmol/L時，三元體系粒徑的變大趨勢變緩，當Na濃度為100 mmol/L時，二元體系的平均粒徑達450 nm，而三元體系的粒徑僅為350 nm，可見甜菊苷的引入使得復合體系的耐鹽性更好。

由圖4可以看出，在復合體系中，隨著Na濃度的升高，葉黃素的乳化產率變化不明顯，但在不同Na濃度下，CPI-STE-LUT體系的葉黃素乳化產率均高于CPI-LUT。

2.3 凍融穩定性

反復凍融處理后，載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系的平均粒徑如圖5所示。可以看出，凍融處理后CPI-STE-LUT、CPI-LUT復合體系的粒徑明顯增大，體系出現絮凝沉淀現象，且甜菊苷的加入并不能抵抗凍融處理對體系的破壞作用。如圖6所示，經過凍融處理后，CPI-STE-LUT、CPI-LUT復合體系的葉黃素乳化產率較低，表明復合體系結構已經被破壞，不能有效負載葉黃素。凍融處理對復合體系的破壞力極大，因為體系在冷凍過程中，水快速結冰，造成體系體積變大而形成網狀冰晶結構，且冰晶大小、分布都不均勻，不規則的冰晶會插入蛋白質顆粒中，引起界面蛋白質結構的變化，從而破壞了構建的多元復合體系顆粒結構，進而使粒子間的相互作用力失衡，系統穩定性下降；較大的冰晶顆粒會對復合體系顆粒造成擠壓，使它們粘連在一起，導致平均粒徑異常變大，其次，在解凍過程中，冰晶所構成的網狀結構塌陷，冰晶融化、形成空隙，造成復合顆粒結構被進一步破壞。研究發現，在凍融處理過程中，蛋白質會發生變性，如物理、化學及膠束變化，這也會影響體系的穩定性。

2.4 貯藏穩定性

不同貯藏溫度及光照條件下載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系的平均粒徑變化規律見圖7。可以看出，在貯藏過程中體系的平均粒徑呈現增大趨勢。貯藏溫度對體系平均粒徑的影響大于光照。在貯藏前5 d，體系粒徑增加得最快，而后趨于平緩。在4 ℃避光條件下，體系最為穩定，平均粒徑基本沒有變化。

如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，葉黃素保留率逐漸降低且在貯藏前的下降速度最快， 其后趨于平緩。在37 ℃光照條件下，葉黃素降解得最快，在貯藏30 d后，葉黃素保留率僅為10%左右，而在4 ℃避光條件下，葉黃素保留率達50%以上。伍敏暉等研究發現，乳清蛋白負載姜黃色素在4 ℃貯藏 25 d 后，色素保留率僅為50%，在37 ℃貯藏30 d后不足5%。除25、37 ℃光照條件外，復合體系在貯藏末期無分層現象，仍保持澄清透明的橙黃色液體狀態。

2.5 模擬胃腸液中的穩定性

如圖10所示，CPI-STE-LUT和CPI-LUT 2種復合體系在胃液中消化1.5 h時，葉黃素保留率均在90%以上。在模擬胃腸液的消化過程中，隨著消化時間的增加，葉黃素的保留率下降，模擬胃腸液消化1 h后，CPI-LUT復合體系中葉黃素的保留率下降得較快，但CPI-STE-LUT復合體系中葉黃素保留率下降得較緩慢；模擬胃腸液消化2～3 h時，CPI-STE-LUT復合體系的葉黃素保留率下降得較快；模擬胃腸液消化3 h后，葉黃素保留率的下降趨勢變緩；模擬胃腸液孵育7 h后，2種復合體系葉黃素的保留率在80%左右。可以看出，三元體系能夠有效負載葉黃素不被腸道中的消化酶降解，可能由于甜菊苷減少了蛋白質表面基團與胃腸液中的消化酶反應，能夠保持復合體系結構的完整，從而減少葉黃素損失。

3 結論

載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復合體系是一種較好的營養補充劑，CPI-STE-LUT三元復合體系的耐鹽性及耐酸性高于CPI-LUT二元復合體系，且CPI-STE-LUT三元復合體系在中堿性及低鹽條件下的穩定性良好。凍融處理會破壞復合納米顆粒的結構，進而使復合體系失穩。貯藏溫度對體系色澤的影響作用大于光照，適宜在4 ℃避光條件下貯藏。CPI-STE-LUT三元復合體系在胃腸液中的穩定性高于CPI-LUT二元復合體系，其能更加有效的負載葉黃素，不被胃腸液中的消化酶降解。CPI-STE-LUT三元復合體系在不同功能食品與飲料中的應用有待進一步展開。